本文要点：第二近红外（NIR-II）窗口中缺乏具有高量子产率（QYs）和低肝保留的有机荧光团已成为生物成像领域的瓶颈。本文提出通过将磷酸化荧光染料包封到可生物降解的磷酸钙纳米颗粒中来解决这些问题。首先，NIR-II分子LJ-2P通过引入两个磷酸基团来增加水溶性。同时，LJ-2P与钙离子共沉淀，形成LJ-2P纳米颗粒（NPs）。与LJ-2P相比，LJ-2P NPs在水溶液中的QYs增加了36.57倍，达到5.12%。这种独特的现象被称为沉淀增强发射（PEE），其详细机制通过飞秒瞬态吸收进行探索。结果表明，LJ-2P与钙离子的共沉淀改变了微环境，限制了分子的旋转并减少了水分子的相互作用，特别是激发态质子转移。此外，由于对pH敏感，80%以上的LJ-2P NPs24小时内在肝脏被代谢。基于优异的光学性能和良好的生物相容性，实现了高对比度的血管可视化和乳腺肿瘤检测。该策略可应用于其他NIR-II荧光团，以实现高QYs和低肝脏保留。

背景：截止到目前，已经报道了一系列开发高亮度NIR-II荧光团的策略。例如，将荧光团与胎牛血清(FBS)结合形成稳定的蛋白质-荧光团复合体。由于荧光团分子内旋转受限，以及荧光团核心与周围水分子间相互作用减弱，复合物的QYs通常高于单独的荧光团。用聚集诱导发射(AIE)基团修饰荧光团也是改善极性溶剂中QYs的有效方法。其他策略如抑制激发态的扭曲分子内电荷转移(TICT)，扭曲共轭骨架，以及引入刚性结构也已被报道。虽然这些策略显示了良好的效果，但在临床应用中仍存在一些问题，如FBS成分复杂或AIE等分子在肝脏中严重积累。因此，本文合理设计了一种具有两个磷酸基的D-A-D分子LJ-2P。LJ-2P的磷酸盐基团与钙离子共沉淀形成LJ-2P NPs。一方面，沉淀产生的微环境限制了分子运动和分子内旋转，提高了QYs。另一方面，LJ-2P NPs在LJ-2P分子周围形成空腔，有效减少了核骨架与水分子的相互作用。此外，通过引入两个磷酸盐基团，提高了分子在水中的溶解度。水溶性分子被包封在对pH敏感的LJ-2P NPs中，以改善其在肝脏中的长期积累。总之，我们的PEE策略不仅改善了QYs，而且提高了体内生物相容性。

研究内容：我们选择了具有较高化学稳定性和光稳定性的苯并[1,2-c:4,5-c’]双([1,2,5]噻二唑)(BBTD)衍生物作为模型分子。如Figure.1A所示，LJ-2P是从市面上可用的起始材料按照9步路线合成的。这条路线包括了傅克酰基化和铃木偶联反应等关键的反应。由于BBTD核心在碱性条件下容易分解，因此选择了氯氧磷进行磷酸化。用氯氧磷成功地将两个磷酸基引入荧光团中，得到理想产物LJ-2P，不仅提高了水溶性，而且为实现PEE奠定了基础。在B3LYP /6-31G(d)水平上使用高斯09程序进行密度泛函理论(DFT)计算，得到LJ-2P分子的最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占分子轨道（Figure.1B）。HOMO在芴和BBTD单元上离域，而LUMO主要定位在缺电子的BBTD单元上。带隙为1.56 eV，窄带隙有利于NIR-II窗口的强吸收。

Figure 1

采用反向微乳液法构建具有高亮度和良好生物相容性的LJ-2P NPs（Figure.2A）。将溶解在Na2HPO4溶液中的LJ-2P分散在环己烷/聚氧代乙烯 (5)壬基苯基醚中形成P相。将CaCl2溶液分散在环己烷/聚氧代乙烯（5）壬基苯基醚中形成Ca相。然后将P相加入到Ca相中形成无定形的CaP沉淀，再用二油酰磷脂酸钠盐（DOPA）稳定得到LJ-2P NPs核心。透射电子显微镜(TEM)显示，LJ-2P NPs核心的平均直径为≈5 nm，而动态光散射(DLS)分析测得的尺寸因水化半径而略大(≈9 nm，Figure.2B)。进一步用DSPE-mPEG2000对LJ-2P核粒子进行封装，得到LJ-2P核粒子。合成的LJ-2P NPs具有较高的单分散性，TEM测定其平均粒径为≈25 nm, DLS测定其水动力直径为≈44 nm(Figure.2C)。通过紫外-可见-红外吸收光谱和NIR-II荧光发射光谱对LJ-2P和LJ-2P NPs的光物理性质进行了表征(Figure.2D)。LJ-2P和LJ-2P NPs在水中的zui大吸收波长分别为736 nm和773 nm。有趣的是，LJ-2P和LJ-2P NPs都表现出明显的双发射带。LJ-2P和LJ-2P NPs在943 nm处表现出相似的窄发射带，而宽发射带分别在1059和1029 nm处。同时，我们测量了LJ-2P在FBS、H2O和THF中的QYs和LJ-2P NPs在H2O中的QYs(Figure.2E)。LJ-2P在THF中的QYs高达17.38%，表明了分子设计的优越性。而随着溶剂极性的增加，LJ-2P的QYs在H2O中急剧下降至0.14%。LJ-2P包封到LJ-2P NPs后，分子的亮度明显恢复。与LJ-2P在水中相比，QYs增加了36.57倍，达到5.12%。此外，FBS中LJ-2P的QYs值为3.33%，增强了23倍，而在H2O中只有LJ-2P NPs的2/3。LJ-2P和LJ-2P NPs的光稳定性是通过连续的激光照射（808 nm, 90 mWcm−2）60min来评估的。每10 min记录荧光强度I/I0的变化(Figure.2F)。光稳定性好，荧光强度无明显下降。而ICG对照溶液的荧光强度在1 h内稳定下降到接近0，表明ICG已经分解。

Figure 2

PEE机制：直观地看，PEE可以限制沉淀染料的分子运动。在此，首先通过荧光强度测量来评估分子运动随温度升高的变化。当温度从20℃升高到60℃时，LJ-2P的荧光强度被猝灭了67%，而在80℃时衰减达到91%。这表明LJ-2P在较高的温度下存在剧烈的分子运动，并且光子衰变的大部分是通过非辐射途径发生的。相比之下，LCP NPs的荧光强度在60℃和80℃时分别减弱了18%和33%，表明LJ-2P NPs内部的分子运动并不激烈。因此，我们认为纳米颗粒内的沉淀剂严格约束了荧光团的运动。Figure.3AB分别为LJ-2P NPs和LJ-2P在780/740 nm激发下，功率强度为30μW的二维超快TA光谱。三种激发态动力学由LE（局部激发）和ICT（分子内电荷转移）状态之间的构象诱导电荷转移速率（τ1），ICT状态发射（τ2）和LE状态发射（τ3）表征。然后我们提出了LJ-2P和LJ-2P NPs的电荷转移反应路径，如Figure.3C所示。与LJ-2P相比，LJ-2P的磷酸基与钙离子的结合限制了分子的旋转，导致LE和ICT态之间能量屏障更高。因此，LJ-2P NPs的LE状态贡献了更高比例的发射带(Figure.2D)。实验表明，纳米粒子的形成进一步限制了水与荧光团的接触，削弱了ESPT效应，从而引起了PEE现象(Figure.3E)。

Figure 3

体内血管和肿瘤成像：作者首先测试了LJ-2P NPs的肿瘤血管成像能力。用不同的LP过滤片测量活小鼠肿瘤血管的NIR-II荧光成像(Figure.4AC)。不同波长的空间分辨率由微血管的半zui大宽度(FWHM)来评价。同一位置的血管FWHM分别为352 (LP1000 nm)和314 (LP1150 nm)µm(Figure.4BD)。随着滤光片波长的增加，出现了一个更尖锐的峰值(较低的FWHM)。此外，图像的信噪比随着LP滤光片波长的增加而增加。信噪比从LP1000 nm处的2.56增加到LP1150处的3.73。这些结果证实了LJ-2P NPs在肿瘤血管成像方面的卓越性能。接下来，作者评估肿瘤部位随时间变化的荧光强度。如Figure.4EF所示，肿瘤内荧光强度随时间逐渐增加，在注射后约3 h达到峰值，肿瘤对正常组织的平均荧光强度最高(T /NT = 4.84)。前3小时内的LJ-2P NPs在肿瘤的积累是由于增强的渗透性和保留 (EPR)效应。之后，肿瘤部位的荧光信号减弱，这是由于LJ-2P NPs的清除。最后时间点处死小鼠，切除主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)进行HE染色。LJ-2P NPs无器官毒性。这些结果表明，LJ-2P NPs可作为NIR-II肿瘤诊断的荧光团。

Figure 4

体内代谢：最后，作者研究了LJ-2P NPs在体内的代谢。先前的研究表明，低pH可以溶解CaP核，导致NPs解离。X射线证明CaP的主要成分是羟基磷灰石，在酸性条件下表现出较高的溶解速率和较快的降解速率。在体外细胞水平也观察到在低pH值下Ca2+的释放。假设LJ-2P NPs在体内酸性环境下分解，释放出水溶性的LJ-2P，促进进一步代谢（Figure.5 A）。为了证明LJ-2P NPs对pH的敏感性，在pH 5.0、6.0和7.4缓冲液中进行体外释放试验(Figure.5B)。释放时间为30 min时，LJ-2P NPs的Ca2+累积溶出度分别为8%、10%和80%，pH值分别为7.4、6.0和5.0。随后，在pH值为7.4的缓冲液中，36 h内LJ-2P的NPs溶解率缓慢增加至14%，而在pH值为5.0时，LJ-2P的NPs溶解率达到89%。在pH6.0缓冲液中释放是中等的，36 h释放43%。基于良好的体外实验结果，进一步评估LJ-2P NPs在体内的肝保留情况。将LJ-2P NPs (2.5 mg kg -1)通过尾静脉静脉注入裸鼠(n = 6)，并于0.5 h、第1、2、4、6、8、11和14天进行全身NIR-II荧光成像，以监测肝脏保留情况(Figure.5C)。荧光强度分析显示，LJ-2P NPs在1天后代谢80%，第8天几乎完全代谢(Figure.5D)。为了进一步验证LJ-2P NPs的荧光衰减可能是由于LJ-2P的代谢，而不是NPs的解体。我们将LJ-2P通过尾静脉全身注射(2.5 mg kg−1)至裸小鼠(n = 6)，并在同一时间点进行全身NIR-II荧光成像(Figure.5E)。第4天80%的LJ-2P被代谢，14天内观察到几乎完全分泌(Figure.5F)。

Figure 5

总结：综上所述，作者通过引入两个磷酸基合成了一种新型的水溶性NIR-II分子LJ-2P。提出了一种能显著提高QYs的PEE策略，并详细探讨了PEE的具体机制，为今后提高QYs的工作提供了启示。此外，LJ-2P NPs在肝脏中的保留时间较短。由于LJ-2P NPs具有优异的光学性能和生物相容性，在血管和肿瘤成像中获得了较高的肿瘤与正常组织的比例。PEE策略也可应用于其他NIR-II荧光团，以扩展生物应用。

参考文献

DOI: 10.1002/smll.202204153

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