本文要点：肾脏纤维化在世界范围内普遍存在，因此早期诊断具有重要意义。近红外窗口光学成像已被公认为一种及时发现肾功能障碍的有吸引力的技术。然而，研制一种能够早期监测肾脏纤维化并同时可清除正常人群肾脏中的造影剂仍然具有挑战性。本文精心设计了一种具有聚集诱导发射(AIE)特征的纳米荧光团，即AIE- 4PEG550 NPs。适用于通过短波红外(SWIR, 900-1700 nm)荧光和光声双峰成像对纤维化的早期进展纵向可视化。AIE-4PEG550 NPs体积小(约26 nm)，肾脏可过滤分子量为3.3 kDa，肾脏清除率高(24 h内通过肾脏排出93.1±1.7%)，出色的成像性能和良好的生物相容性，这些特点使AIE-4PEG550 NPs远远优于临床诊断测定。本研究的发现将为下一代诊断肾纤维化程度的试剂提供了蓝图。

背景：慢性肾脏疾病(CKD)的流行极大地影响了全世界人民的健康。鉴于CKD发病率高、潜伏期大的特点，为防止情况恶化为严重的肾功能障碍，早期识别纤维化肾脏组织是必要的。截至目前，评估肾脏纤维化可通过肾脏活检、计算机断层扫描CT、正电子发射断层扫描PET、磁共振成像MRI等，但这些方法可能面临高出血风险、设备的不可及性，高辐射风险和含重金属造影剂诱发的潜在肾毒性。因此，本文提出的AIE- 4PEG550 NPs以一种非侵入性的成像方式，高灵敏度的光学成像、优越的空间和时间分辨率、多功能和各种成像剂的可及性对早期的肾脏纤维化进行实时诊断。

研究内容：分子设计和光物理性质研究：首先通过简单的步骤得到目标荧光团AIE-4COOH，关键步骤有 4，4'-（苯基氮杂二酰基）二苯甲醛与化合物1之间的Wittig反应，4,7-二溴5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑(DPTQ)与中间体5之间的Suzuki偶联反应。为了使生成的AIE-4COOH具有良好的水溶性，将羧基与0.55 kDa PEG-NH2进一步聚乙二醇化，通过简单的缩合反应得到AIE-4PEG550。优化的AIE-4COOH分子几何结构表明，DPTQ核与相邻苯环之间的二面角均为45°，表明分子几何结构充塞，有助于抑制π-π的堆积。除了三苯胺单元中的三个立体拥挤苯环外，DPTQ核中还有两个可自由旋转的苯环，喹喔啉核与相邻苯环之间二面角为39°(Figure.1A)。如Figure1B所示，最低未占据分子轨道的电子密度(LUMO，-3.05eV) 主要集中在缺电子的DPTQ核上，而最高占据分子轨道(HOMO， -4.87 eV)沿共轭骨架分布，表明分子内电荷转移特性突出。AIE-4COOH的最大吸收峰在~ 630 nm处，发射峰在910 nm处(Figure.1C)。随后使用不同水比例的DMSO/水体系对AIE特征进行了探索。如Figure1D所示，当水比逐渐增加到70%时，AIE-4COOH的亮度增强。AIE4PEG550在水中溶解良好，在645 nm处有一个吸收峰，摩尔吸收系数(ε)为5.8 × 104 M-1cm-1，在SWIR区有一个最大发射峰，尾延伸到第二近红外窗口(NIR-II, 1000-1700 nm)(Figure.1E)。同时，AIE- 4peg550在DMSO/水混合物中也表现出良好的AIE特征，动态光散射(DLS)分析显示，AIE-4PEG550 NPs的流体动力学直径为26 nm，适合于肾脏清除(Figure.1F)。如Figure1G所示，AIE-4PEG550 NPs的荧光强度随着浓度的增加而增加，在60 μM浓度下仍能保持较高的发射强度，这有利于染料在靶位点的积累。相反，市售吲哚菁绿(ICG)在浓度低于5 μM时发射量逐渐增加，高浓度时发射量急剧下降。此外，AIE-4PEG550 NPs表现出可接受的光稳定性，因为在连续660 nm光照30分钟后，监测到的发射强度只有轻微下降。相反，经过相同处理后，ICG完全光漂白(Figure.1H)。

Figure 1

人类肾脏细胞的荧光成像: 随后采用标准的CCK-8实验评估了AIE-4PEG550 NPs对体外HK-2细胞的细胞毒性。如Figure.2A所示，NPs表现出良好的生物相容性，在0 ~ 100 μ g mL-1的材料存在下，存活率超过95%。培养24小时后，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和SWIR显微镜成像观察AIE-4PEG550 NPs的细胞摄取，并用核特异性蓝色荧光染料联合染色验证(Figure.2B)。如Figure.2C所示，60次循环扫描后，保留了80%的初始荧光强度，成像稳定性良好。

Figure2

活体肾纤维化的光学成像: 我们将AIE-4PEG550 NPs静脉给药给正常C57BL/6小鼠(简称“正常”组)。如Figure.3A所示，AIE-4PEG550 NPs处理4 min后，使用900 nm长通滤波器，通过FLI在SWIR区域可见双侧肾脏的轮廓。值得注意的是，由于肾脏排泄效率极好，肝脏几乎没有信号。肾脏信号在注射后4min迅速上升至峰值，40min后逐渐消失。多次证实PAI结合了优越的空间分辨率和深度穿透深度的优点。如Figure.3B所示，在肾脏部位可见到较强的PA信号，与FLI所得结果一致。同时，膀胱内AIE-4PEG550 NPs产生的荧光信号和PA振幅随着时间的推移不断增加，在给药后60 min达到最大值。然后，这些物质可以通过尿液从膀胱中彻底排出，避免潜在的毒性(Figure.3CD)。定量分析表明，注射后4 min和60 min，肾脏区域FLI/PAI强度分别比未注射的小鼠高1.63/4.8倍和1.08/1.04倍。膀胱的相应数据分别为1.89/4.78倍和4.69/16.4倍，说明AIE-4PEG550 NPs从肾脏向膀胱的排泄速度较快(Figure.3EF)。

Figure3

在确认其对正常肾脏小鼠的超快肾脏排泄能力后，作者进一步利用AIE-4PEG550研究其在叶酸诱导的肾病模型中的行为，这是一个完善的模型，发展为肾小管间质纤维化。与肾功能正常组形成鲜明对比，180min内荧光强度持续增强，表明AIE-4PEG550在肾脏内蓄积(Figure.4AB)。由于肾脏功能障碍，通过尿液排泄的代谢减慢，在180分钟内，膀胱内的FL/PA强度明显减弱，并以温和的速度增长 (Figure.4DE)。直观量化的变化表明，在20、60和180分钟后FLI/PAI信号在指定肾脏区域分别比预处理小鼠增加2.26/1.5、2.78/5.5和4.06/10.0倍(Figure.4G)。平行比较三组肾脏的FL强度。如Figure.4H所示，“1周”组的FL强度在180 min内持续上升至4.07倍，与其他两组形成了鲜明的对比。具体来说，正常组的FL信号与注射后40 min的背景信号相似。而“4周”组，给药后FL信号维持在1.6倍左右。此外，肾脏-膀胱(Rktb)的FL强度比被评估为时间的函数，从中我们可以清楚地识别肾脏纤维化:Rktb > 1表示肾脏早期纤维化(Figure.4I)。

Figure4

与其他检测方法比较：对肾组织进行H&E、Masson三色染色等组织学分析，定量评估间质纤维化面积，成功建立不同程度肾纤维化小鼠模型(Figure.5 AB)。临床评估肾功能障碍的诊断方法主要依赖血清肌酐(sCr)、血尿素氮(BUN)和肾小球滤过率(GFR)的监测。从Figure5CE中可以看到，尽管“1周”组的sCr和BUN明显比“正常”组增加了2.82倍和1.67倍，但“1周”组的GFRs仅下降了17.4%。值得注意的是，本文开发的诊断方案可以在早期清晰地区分进行性肾纤维化。主要器官的H&E染色显示，AIE-4PEG550 NPs没有诱导各种组织破坏，说明其具有良好的生物安全性(Figure.5F)。

Figure5

总结：本文合成了一种水溶性NIR发射荧光团，即AIE-4PEG550，该荧光团在正常小鼠体内表现出良好的光稳定性和生物相容性，并具有极高的肾脏排泄效率(注射24 h后为93.1±1.7%)。此外，AIE-4PEG550 NPs同时开启SWIR/NIR-II区FL信号和NIR-I区PA信号，可用于无创肾纤维化的实时双模成像和鉴别。在正常和不同程度的肾纤维化小鼠体内注射AIE-4PEG550 NPs后，可通过肾脏和膀胱部位PL/PA信号强度的明显变化实现纵向纤维化分期。与sCr、BUN和GFR等早期诊断肾功能障碍的临床诊断方法相比，AIE-4PEG550 NPs在无创治疗、肾脏清除效率高、生物相容性好等方面表现出明显的优势，因此在临床前肾纤维化检测中具有很大的前景。

参考文献

DOI: 10.1002/adma.202206643

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