本文要点：高空间分辨率、低背景和深层组织穿透力使近红外II（NIR-II）荧光成像成为体内观察和测量的最关键工具之一。然而，合成NIR-II荧光团相对较短的保留时间和潜在的毒性限制了其长期应用。本文报告了红外荧光蛋白（iRFP）作为体外和体内NIR-II探针的使用，允许长时间的连续成像（长达15个月）。作为一个代表性的例子，将iRFP713敲入小鼠基因组以产生一个转基因模型，允许探针在时间和/或空间表达控制。为了证明其在真正的诊断环境中的可行性，采用了两种肝脏再生模型，并成功跟踪了一周的过程。性能和监测效果与μCT相当，优于吲哚菁绿染料。尽管胰xian的位置很深，但也能有效地观察到生理和病理条件下的胰xian。这些结果表明，iRFP辅助的NIR-II荧光系统适用于监测各种组织和体内生物过程，提供了一个强大的无创长期成像平台。

背景：荧光成像是在活体结构和功能研究中应用最广泛的技术之一。使用第二近红外区域(NIR-II, 900-1880nm)成像能够以令人印象深刻的清晰度直接可视化和实时监测深层生物结构和过程。迄今为止，稀土掺杂纳米颗粒(RENPs)，量子点(QDs)和某些有机荧光染料已被开发用于多功能生物医学成像中的NIR-II荧光探针。然而，由于它们是化学合成的，这些探针受到严重的限制，包括它们在生命系统中不可再生，并可能存在潜在的生物毒性风险。在细胞分裂过程中，这种探针在两个子细胞之间的分割将导致信号衰减，导致在多次细胞复制后探针不再被检测到。此外，合成探针可以通过体内的生物过程快速分解或消除，根据类型，外源性荧光探针可能表现出一定程度的细胞毒性。因此，这些探头不适用于长时间成像。作为一种替代且更具生物相容性的选择，荧光蛋白（FPs）在长期监测中比化学合成探针具有很大的优势。已报道了多条近红外FP线。其中，红外荧光蛋白（iRFP）系列，包括iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713和iRFP720，在近红外波长下具有发射和激发光谱。iRFP是杜鹃假单胞菌细菌植物色素的工程版本，可实现无创和长期体内可视化。然而，到目前为止，只有NIR-I区域被开发。为了探索iRFP在NIR-II区域的应用，本文研究证明了iRFP713通过非峰值荧光发射进行NIR-II生物成像具有较高的时间和空间分辨率，具有长期监测能力，可作为各种内部生物过程成像的强大平台。

研究内容：

1、iRFP在NIR-II区的表征和体外成像

为了表征NIR-II区域中的iRFP，本文首先使用蛋白质表达和纯化程序纯化了所有五种报告的iRFP，然后测量了它们的光谱特性（图1ab）。尽管iRFP在可见光和NIR-I区域显示出670至720 nm的最大发射，但它们也表现出900-1300 nm的光谱尾部，表明它们的发射光谱延伸到NIR-II区域（图1c）。这些结果表明，iRFPs具有用作NIR-II成像荧光探针的潜力。为了进一步探索这种可能性，首先在体外测量了每种蛋白质的亮度。当用690 nm连续波（CW）激光器和900 nm长通（LP）过滤器激发时，五种iRFP溶液表现出不同程度的荧光。如图1d所示，它们表现出良好的荧光性能，且iRFP713显示出最亮的相对荧光强度。为了评估iRFP713的组织穿透能力，本文使用含有iRFP713的毛细管在指定深度的1%脂质内溶液中浸泡进行脂质内幻影成像（图1e）。如图1f所示，即使在6 mm的浸泡深度下，管内边界在NIR-II区域（>900 nm）中也可以清晰区分，而在NIR-I区域（800-900 nm）中则模糊不可见。变异系数（CV）值的定量结果进一步表明了iRFP713在NIR-II荧光成像中的潜力。

图1

2、iRFP713的NIR-II体内成像

本文采用基于CRISPR/ Cas9的基因组编辑技术将iRFP713基因敲入小鼠内源性Rosa26位点(iRFP713flox/flox)。具体来说，是将一个lox-stop-lox (LSL)元件放置在iRFP713前面，跟随CAG启动子，防止iRFP713的表达，除非引入Cre重组酶去除停止盒。基因分型分析证实成功构建了所需的转基因小鼠。在与不同组织特异性Cre系的iRFP713flox/flox小鼠杂交后，通过Cre介导的重组，位于两个lox位点两侧的停止元件可以被删除或倒置，导致iRFP713仅在表达Cre的组织中被激活。因此，使用该技术，本文建立一个组织特异性表达irfp713的转基因小鼠(图2a)。为了评估其成像能力，本文生成了一个全身表达iRFP713的小鼠(iRFP713flox/flox;Ella-Cre)通过将iRFP713flox/flox鼠标与EIIa-Cre系杂交。在确认对小鼠没有明显的副作用或健康问题后，我们检查了所需后代的荧光特性。与对照组(iRFP713flox/flox)相比，iRFP713flox/flox；EIIa-Cre小鼠的整个身体表现出明亮的NIR-II荧光（图2b）。进一步检测了表达iRFP713的小鼠在出生后1、3和8周甚至15个月的荧光。结果表明，通过NIR-II成像，可以在所有这些时间点清楚地检测到iRFP713荧光信号（图2bc）。此外，我们能够区分某些器官的边界，例如肝脏，并从不同角度观察内部组织的细节（图2c）。此外，我们对离体器官进行了体外NIR-II荧光成像（图2d）。不同器官的荧光强度各不相同，从肾脏和胃的荧光强度最低，心脏、肺和胰xian的荧光强度较高，肝脏中荧光强度最高（图2de）。这些数据共同表明，基于iRFP713的NIR-II荧光成像可以作为无创组织观察的平台。

图2

3、体内肝脏再生实时追踪

为了测试我们的成像系统是否具有长期观察活体生物过程的潜力，我们使用肝脏再生作为监测模型。为了防止肝脏以外的非靶组织对iRFP713荧光的干扰，比如在表达iRFP713的全身小鼠中，我们认为开发一种表达iRFP713的肝细胞特异性动物更合适。为此，我们将iRFP713flox/flox小鼠与Alb-Cre系杂交，其中Cre重组酶受Alb启动子控制，使Cre只在肝细胞中表达(图3a)。与预期的一样，幼(8周)和大(15个月)的iRFP713flox/flox; Alb-Cre小鼠的肝脏都可以通过NIR-II荧光清晰可见，而对照组没有显示任何荧光（图3b）。接下来，我们在iRFP713flox/flox;Alb-Cre小鼠中建立了部分肝切除术(PHX)模型以监测肝脏再生过程。在该模型中，大约三分之二的肝脏被手术切除，然后肝脏在7 - 10天内通过肝细胞的增殖恢复到原来的质量(图3c)。如图3d所示，当从右侧观察时，NIR-II荧光成像能够清楚地分辨PHX小鼠中包含三个部分（中叶，左叶和右叶）的正常“冠状”形状，并能看到切除中叶和左叶后残余肝脏。荧光的面积和强度从第1天到第7天逐渐增加，肝脏相应恢复和再生。为了提供参考标准，我们还通过造影剂增强μCT定量测量了残余肝体积，这在临床环境中通常用于肝脏诊断μCT分析显示，切除术后肝容量显著增加，第5天和第7天分别为191.0%±35.0%和218.3%±53.8%（图3d）。然后，我们估计了μCT肝脏测量数据与iRFP713辅助NIR-II荧光成像的相关性。iRFP713荧光面积数据与μCT测量的体积（R2= 0.9595，p< 0.01）（图3d），表明我们的系统在小鼠肝脏可视化方面可与经典的μCT相媲美。吲哚菁绿（ICG）是一种临床批准的安全荧光染料，用于肝脏研究和近红外荧光成像。为了比较iRFP713和这种染料的性能，我们在PHX模型中使用ICG进行了NIR-II成像。与iRFP713不同，我们必须在每次观察之前通过尾静脉单独给予ICG。ICG辅助成像没有提供清晰的肝脏与其他组织对比，因为染料被迅速代谢并且无法特异性地积聚在肝脏中（图3e）。我们还采用了经典的化学肝损伤模型，对乙酰氨基酚（APAP）驱动的肝脏再生，评估iRFP713和ICG的可视化功能。iRFP713辅助成像显示，由于APAP诱导的肝细胞死亡，肝脏荧光强度在第1天下降了62.8%（图3f），但在第2天和第3天分别增加了17.4%和35.1%（图3f）。这种“先跌后升”的现象与急性肝损伤的病理过程一致，急性肝损伤表现出明显的损伤和消退阶段。然而，在基于ICG的成像中没有观察到显着变化（图3f）。

图3

4、胰xian的无创长期可视化

胰xian作为位于深部的器官之一，兼具内分泌和外分泌功能，与糖尿病和胰xian炎等常见疾病过程明显相关。为了测试我们的系统如何在这种深层组织中工作，我们将iRFP713flox/flox与Pdx1-Cre品系杂交，生成胰xian特异性iRFP713表达的小鼠 (iRFP713flox/flox;Pdx1-Cre)（图4a）。在NIR-II成像下，无论小鼠是年轻（8周）还是老年（15个月），胰xian中的荧光清晰，而它们的对照组则缺乏任何明显的NIR-II荧光信号（图4b）。然后，我们通过在剖腹手术期间在充满液体的胰xian和分离的胰xian中检测来自胰xian内部的荧光信号，在这只转基因小鼠中确认了胰xian特异性iRFP713荧光(图4c)。为了验证病理条件下的胰xian成像能力，我们首先使用链脲佐菌素（STZ）生成糖尿病模型。在这里，iRFP713fiox/flox;Pdx1-Cre小鼠被施予多种低剂量的STZ以诱导胰xianβ细胞衰竭和死亡。然后，我们在不同的时间点进行了NIR-II荧光成像。如图4d所示，胰xian的荧光信号在STZ注射后第1、3、5和7天略有下降，但差异无统计学意义（图4d）。我们认为这主要是因为整个胰xian中表达iRFP713的β细胞百分比低。为了应对这一挑战，我们给小鼠施用蔚蓝素以诱导急性胰xian炎（图4e）。在该模型中，胰xian腺泡细胞（主要的表达iRFP713的细胞）是天青素的靶标。影像学结果显示，腹腔注射天青素1天后，iRFP713荧光显著下降，随后随着胰xian从急性胰xian炎中恢复，荧光显著升高（图4f）。这些数据表明，胰xian特异性iRFP713的NIR-II成像可用于监测生理和病理条件下的胰xian。

图4

总结：通过使用蛋白质iRFP713作为探针，我们开发了一种生物相容性和可再生体内NIR-II监测方法，具有深度穿透性和高成像对比度。该平台不仅适用于准备组织特异性表达时的单组织观察，而且还能够实现任何器官的长期可视化。我们相信，该平台可以作为长期监测许多活体生物过程的有力工具。

参考文献

doi.org/10.1038/s41467-022-34274-w

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近红外二区小动物活体荧光成像系统 - MARS 

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