本文要点：光声成像(PAI)/第二近红外窗口荧光成像(NIR-II FI)双模式成像技术由于具有较高的空间分辨率和信噪比，在检测肿瘤组织和前哨淋巴结(SLN)方面具有广阔的应用前景。本研究以苯并噻二唑为电子受体，开发了两种聚集诱导发光剂(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD)，首次将PAI/NIR-Ⅱ FI应用于神经内分泌肿瘤(NENs)及其SLNs的诊断和治疗。其中，C-NTBD纳米粒子具有较好的PAI和NIR-II荧光性能，其最大吸收波长位于732 nm，发射峰位于1042 nm。在荷NENs裸鼠模型中，在PAI术前成功定位NENs后，再用NIR-II FI检测SLN。在C-NTBD纳米粒子的NIR-II FI引导下，发现并精确地切除了位于胸壁的远离原发肿瘤部位的直径为1 mm的SLN。

背景：神经内分泌肿瘤(NENs)是一组起源于肽能神经元和神经内分泌细胞的高度异质性的恶性肿瘤，易发生淋巴结转移。现代影像技术仍然无法准确识别微小的NENs病变组织和SLNs(毫米级)。为了克服单一成像模式的不足，多模式成像技术被开发出来，以综合两种或两种以上成像模式的优点。由于PAI的高空间分辨率和NIR-II FI的高信噪比的优势互补，PAI/NIR-II FI双模态成像技术在肿瘤组织和SLNs的检测中显示出巨大的应用前景。术前PAI成功定位肿瘤组织后，术中NIR-II FL可准确检测SLNs，预防性剥离SLNs，降低肿瘤残留率。然而，在以往的研究中，PAI/NIR-II FI主要应用于肿瘤的诊断，而其在肿瘤和SLN诊断中的应用研究较少。

研究内容：本研究以苯并噻二唑为电子受体，开发了两种聚集诱导发光剂(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD)，首次将PAI/NIR-Ⅱ FI应用于神经内分泌肿瘤(NENs)及其SLNs的诊断和治疗。其中，C-NTBD纳米粒子具有较好的PAI和NIR-II荧光性能，其最大吸收波长位于732 nm，发射峰位于1042 nm，血管造影分辨率高达20μm。在C-NTBD纳米粒子的实时NIR-II FL引导下，发现并精确地切除了位于胸壁的远离原发肿瘤部位的直径为1 mm的SLN。这种双模态成像技术可以提高术中切除SLNs的准确性，改善患者的预后，为准确治疗NENs提供新的策略。(Scheme 1)

首先，作者进行了分子设计和合成，然后进行了理论计算。为了探索更多的C-NTBD和O-NTBD的结构信息，用Gaussian 09 W程序，用B3LYP/6-31G*基组模拟了它们的分子优化结构和分子轨道能级信息。C-NTBD和O-NTBD都表现出扭曲的立体结构，这可以有效地防止聚集态的堆积(例如，π-π堆积)。C-NTBD和O-NTBD在π电子传递单元和电子受体苯并噻二唑之间的二面角分别为48.1◦和38.7◦(图1B)。C-NTBD的分子结构比O-NTBD更扭曲，这更有利于分子激发态能量通过辐射途径耗散。如图1C所示，C-NTBD和O-NTBD的最低未占分子轨道(LUMO)电子密度都主要集中在苯并噻二唑部分，而它们的最高占据分子轨道(HOMO)的轨道能级沿分子骨架均匀分布。

Figure 1

然后作者研究了C-NTBD和O-NTBD的光物理性质。C-NTBD的吸收峰和摩尔消光系数(ε)如图2a所示。O-NTBD与C-NTBD相比吸收峰红移，因为烷氧基比乙基具有更强的供电子能力，这一结果与激发态计算相一致。作者还研究了聚集态分子的吸收性能。将9倍体积的水加入到DMSO溶液中(水的分数为90%)，制备了分子聚集体。如图2B所示，C-NTBD在聚集体中的吸收峰移动到了746 nm，O-NTBD在聚集体中的吸收峰也发生了移动(795 nm)。C-NTBD在808 nm处的ε比O-NTBD在溶液和聚集态下的高，这有利于C-NTBD更多地吸收光能，转化为近红外-II荧光和热。作者使用灵敏度更高的近红外成像系统(1000nm LP滤光片)来测定C-NTBD和O-NTBD的ΦPL。如图2C所示，O-NTBD的ΦPL为0.83%，而C-NTBD的ΦPL为0.22%。作者还测量了它们在不同比例的DMSO/甲苯体系中的光致发光强度。这两个分子都显示出典型的AIE特征，因为荧光强度随着甲苯组份(Ftol)的增加而增加(图2D)。

Figure 2

接下来，作者对C-NTBD和O-NTBD进行PEG化修饰(图3A)得到C-NTBD NPs和O-NTBD NPs，并对其进行表征。动态光散射(DLS)结果表明，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs平均流体动力学直径分别为142.49 nm和129.34 nm(图3B)。TEM结果表明，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs具有均匀的球形结构，平均直径分别为139 nm和111 nm(图3B)。与C-NTBD NPs相比，O-NTBD NPs的最大吸收波长(776 nm比732 nm)和发射峰(1110 nm比1042 nm)显著红移(图3C)。在808 nm激光激发和1000 nm LP滤光片上，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs都显示出显著的荧光信号，其中C-NTBD NPs发射出更强的荧光信号(图3D)。C-NTBD NPs在9 mm鸡胸肉覆盖下显示出明显的NIR-II荧光信号，而O-NTBD NPs在6 mm鸡胸组织覆盖度下的荧光信号非常微弱(图3D)。这些结果表明，与O-NTBD NPs相比，C-NTBD NPs的NIR-II成像能力更好。

Figure 3

随后，作者用热成像仪研究了C-NTBD纳米颗粒和O-NTBD纳米颗粒在不同浓度下随808 nm激光照射时间的温度变化，进一步评价了它们的光热转化性能(图4a和图4b)。在808 nm激光(0.5W/cm2)照射下，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的温度都迅速上升，并在激光照射5分钟后达到稳定水平(图4a&b)。C-NTBD纳米粒子和O-NTBD纳米粒子表现出浓度依赖的光热效应。C-NTBD纳米颗粒表现出比O-NTBD纳米颗粒更好的光热性能(5min的ΔTmax分别为49.8◦C和43.6◦C)(图4C)。此外，C-NTBD纳米颗粒和O-NTBD纳米颗粒的光热性能在5次加热-冷却循环后保持不变，证实了它们良好的光热稳定性(图4D)。

Figure 4

作者进一步研究了它们的PA性质。C-NTBD NPs和O-NTBD NPs分别在755 nm和785 nm的激光波长下获得了最大的PA强度。在760 nm激光照射下，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的PA信号都随着AIEgens浓度的增加而增强，并在3.125-100μM的浓度范围内呈线性关系(图5a和b)。C-NTBD纳米粒子在体外表现出比O-NTBD纳米粒子更好的PAI性能，这与其光热性能是一致的。如图5C所示，在给药C-NTBD NPs(0 h)之前，肿瘤部位有微弱的PA信号。静脉注射C-NTBD NPs后8h达到最大值，提示注射后8h是STC NENs进行PAI的最佳时间点(图5C和图5D)。这些结果证实C-NTBD NPs可作为NENs的有效的高对比度PAI探针。

Figure 5

作者还通过静脉注射在BALB/c裸鼠大脑皮层血管中进一步评估了C-NTBD NPs用于NIR-II FI的体内性能。如图6A所示，静脉注射C-NTBD NPs 5分钟后，大脑皮质血管显示明亮的近红外-II荧光信号(由1000 nm LP滤光片采集)，成像深度为300μm，清楚地显示了大脑皮质丰富的血管网络。为了进一步评估血管成像的分辨率，选择其中一个大脑皮层区域进行放大研究(图6B)。大脑皮质微血管的荧光信号仍然清晰明亮，分辨率高(20μm)(图6D)。这些结果证明了C-NTBD纳米粒在体内具有显著的NIR-II荧光能力。

Figure 6

最后作者在体内NIR-II FI引导下对荷瘤裸鼠模型进行了SLNs手术。瘤内注射C-NTBD NPs后，用NIR-II实时成像系统(808 nm激光激发，1000 nm LP滤光片)对荷瘤裸鼠全身进行成像。注射后1分钟，除肿瘤部位可见明亮信号外，SLN的信号以及两者之间的淋巴引流信号也隐约可见(图7B)。值得注意的是，其中一个SLN位于胸壁，远离原发肿瘤部位，在常规SLN解剖中极易被忽视。15分钟后(图7C)，邻近SLN、远端胸壁SLN的信号及两者之间的淋巴引流信号更加明显，在注射后1h内，信号强度随时间增加(图7D)。然后，作者在已建立的NENs模型中实施NIR-II FI引导下的SLNs手术。首先切除SLNs区域的表皮，然后再次进行NIR-II FI。与去除表皮前相比，SLNs信号亮度增加(图7e和f)，表明外科手术位置是准确的。随后，在NIR - II荧光信号的引导下，SLN被精确地移除(图7g )。手术时间约为10分钟，分离淋巴结的大小约为1mm(图7h和i)。切除肿瘤和SLN后进行H&E和免疫组织化学(IHC)染色，以确认切除的肿瘤是NENs及其SLN(图7j-o )。

Figure 7

总结：作者设计和合成了两种以苯并噻二唑为电子受体的NIR-II类发光试剂(C-NTBD和O-NTBD)。为了使疏水的C-NTBD和O-NTBD具有良好的水分散性，采用纳米沉淀法制备了C-NTBD NPs和O-NTBD NPs 。体外研究表明，与O-NTBD NPs相比，C-NTBD NPs具有更好的光热、PAI和NIR-II FI性能。以C-NTBD NPs为造影剂，首次将PAI/NIR-II FI应用于神经病变组织和SLN的识别和治疗。在C-NTBD纳米粒子的实时NIR-II FL引导下，甚至发现并精确地切除了位于胸壁的远离原发肿瘤部位的1 mm SLN。这项工作为NENs的临床治疗提供了一种很有前景的方法。

参考文献

doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121780

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