本文要点：在肺癌手术中，肿瘤边界的确定和切缘距离的确定是非常重要的。在以往的研究中，系统应用荧光探针可以帮助医疗人员确定肿瘤边界，发现小肿瘤和转移灶，从而提高手术切除的准确性。本文开发了一种新的技术，可以在手术中快速识别切除肺组织中的肿瘤区域，区分肿瘤边界和转移淋巴结。

实验设计：在动物实验中，建立了肺癌的PDX模型。手术切除荷瘤小鼠的肿瘤、肺和瘤周肌肉组织，用靶向表皮生长因子受体(EGFR)探针孵育20分钟，然后用封闭场近红外II区(NIR-II)荧光成像系统成像。临床标本为10例根治肺癌患者手术切除的10个肺组织和60个淋巴结，术中切除后立即用靶向探针进行培养并成像，以识别肿瘤区域，区分肿瘤边界和转移淋巴结。HE染色和免疫组化证实了荧光成像的准确性。

结果：体外动物成像实验显示肿瘤组织荧光增强。对于临床样本，本文的结果表明，这种新技术在识别切除肺组织中的肿瘤区域时具有超过85.7%的敏感性和100%的特异性。肿瘤与背景的平均荧光比为2.5±1.3。此外，本文还将该技术应用于术中转移性淋巴结成像，发现转移性淋巴结的荧光比正常淋巴结更亮，肿瘤与背景的平均荧光信号比为2.7±1.1。计算荧光信号与转移淋巴结数量的关系，灵敏度为77.8%，特异性为92.1%。这项新技术有望成为快速术中病理检测和切缘确定的有用诊断工具。

总结：利用荧光标记的抗人EGFR重组抗体scFv片段在手术中孵育新分离的组织，探针可快速积累在肺癌组织中，可用于快速识别切除肺组织中的肿瘤区域，区分肿瘤边界和淋巴结内的转移灶。该技术有望用于术中快速病理检测和切缘测定。

背景：肺癌是男性和女性最常见的癌症之一，是对人群健康和生命构成严重威胁的恶性肿瘤。手术切除肿瘤是目前肺癌治疗的主要方法之一，因此提高手术切除的准确性对降低肺癌死亡率至关重要。手术前，借助磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描（CT）或PET-CT成像来确定位置和肺癌的大小。然而，在手术过程中，很难确定被切除的组织是否是肿瘤以及手术边缘是否残留有肿瘤细胞。先前的研究表明，术中荧光成像可作为外科医生进行肿瘤切除手术的实用辅助工具。荧光探针的临床应用主要包括全身应用和局部应用两大类。全身应用是指直接将荧光探针引入体内，如ICG和OLT-38。局部应用是指将荧光探针局部喷涂、涂抹到肿瘤区域的方法。该方法操作简单，不良反应率低。然而，与肺癌相关的局部应用研究鲜有报道。

术中病理诊断是在有限时间内进行术中决策的必要条件；诊断结果使医务人员能够制定进一步的手术计划。术中冷冻切片(IFS)技术因其准确、可靠、可降低再手术率等优点被广泛应用于术中病理诊断。然而，IFS也存在一些缺点，如对冷冻切片样品的质量要求非常高。在以往的研究中，荧光成像被用于辅助病理标本的选择。在全身注射靶向荧光剂后，可以对手术标本进行非侵入性成像，客观地确定肿瘤位于离标本深表面最近的位置，然后外科医生可以利用这一信息立即切除额外的组织或将可疑区域的组织样本送往IFS进行进一步评估。受此研究启发，作者认为局部应用靶向荧光探针实现术中有效病理诊断可能更有吸引力，因为这种方法操作简单，不良反应率较低。

本文提出了一种新的方法来实现肿瘤病灶的快速荧光成像。在手术进行过程中，作者将新切除的肺组织与表皮生长因子受体(EGFR)靶向荧光探针孵化，并成功地使用NIR-II荧光成像系统准确地可视化肿瘤的位置和边界。接下来，作者测试了此方法检测淋巴转移的能力。该方法可帮助医护人员测量切缘距离，发现切缘内残留的肿瘤细胞，制定进一步的手术方案。

研究内容：作者首先量化了EGFR在人外科生物标本中的表达(n= 30)。在所有标本中，分析了肿瘤和正常肺组织，发现与正常肺组织相比，肿瘤中EGFR表达明显增加(Figure 1a)。肿瘤组织EGFR阳性区域平均值为31.4%±3.8%(平均±SD)，显著高于正常肺组织(20.1%±3.1%，P < 0.001;Wilcoxon检验)(Figure 1b)。

Figure 1

作者接着完成了EGFR靶向荧光探针的合成及表征。采用抗人EGFR重组抗体scFv片段与近红外荧光染料IRDye800CW偶联制备EGFR-IRDye800CW。IRDye800CW是一种近红外荧光染料，具有广泛的吸收峰(778 nm)和发射峰(794 nm)，具有良好的生物安全性。随后初步评价了EGFR-IRDye800CW的光谱特性。如Figure 2a所示，EGFR-IRDye800CW的吸收光谱峰为790 nm。与IRDye800CW相比，EGFR-IRDye800CW在260 nm处的吸收峰增强，表明IRDye800CW成功偶联到抗人EGFR重组抗体scFv片段上。如Figure 2b和c所示，在接近生理条件下(PBS缓冲液，pH = 7.4)，EGFR-IRDye800CW的荧光信号范围为800 ~ 1200 nm，峰值发射在818 nm。EGFR-IRDye800CW的NIR-II荧光成像进一步显示，当浓度从1 × 10−2增加到1 × 10−1 mg/mL时，荧光信号呈线性增加(R2 = 0.9981，Figure 2d)。透射电镜(TEM)图像显示，EGFR-IRDye800CW的平均粒径约为10.57 nm(Figure 2e)。通过DLS测量，EGFR-IRDye800CW的水化粒径增大了27.2 nm。采用生物分子层干涉法(BLI)检测EGFR-IRDye800CW与抗人EGFR重组抗体scFv片段的结合性。EGFR-IRDye800CW的Kd（结合常数）为0.545 nM，抗人EGFR重组抗体scFv片段的Kd为0.529 nM。由以上结果可知，抗体与染料偶联后，纯度略有下降。

Figure 2

作者继续测定EGFR-IRDye800CW的体外细胞靶向能力和细胞摄取。使用western blotting检测两种人肺癌细胞系：HCC827细胞(腺癌)和NCI-H520细胞(鳞状细胞癌)中的EGFR表达。如Figure 3a和b所示，western blot数据显示，HCC827细胞系的EGFR表达量是NCI-H520细胞系的2.1倍，表明EGFR在HCC827细胞系中呈高表达，两细胞系间存在显著性差异(P<0.001)。为了测试荧光探针EGFR-IRDye800CW的靶向能力，作者在探针100 nM浓度下培养HCC827 (EGFR阳性)和NCI-H520 (EGFR阴性)细胞3小时。然后，用共聚焦激光扫描显微镜对EGFR配体诱导的内吞运输进行荧光成像。如Figure 3c所示，在HCC827细胞中观察到EGFR-IRDye800CW探针明显的红色荧光信号，而在NCI-H520细胞中观察到红色荧光信号较弱；还观察到EGFR-IRDye800CW在HCC827细胞的细胞膜和细胞质中有大量的定位。如Figure 3d所示，HCC827细胞的相对荧光强度达到130.3，是NCI-H520细胞(42.1)的3.1倍。同样，两种细胞系之间有显著差异(P < 0.001)。为了进一步研究HCC827细胞对探针的吸收，本文在另外两组HCC827细胞中进行了实验——阻断组和同型对照组。对于阻断组，采用过量游离西妥昔单抗预处理HCC827细胞以阻断EGFR。结果表明，抗体对受体的阻断降低了EGFR-IRDye800CW探针的吸收，在HCC827细胞中只观察到非常少的荧光(相对荧光强度为66.4，远低于EGFR-IRDye800CW组)。同型对照组用IRDye800CW标记的人抗IgG重组抗体单链抗体片段孵育HCC827细胞;在HCC827细胞中未观察到该同型对照探针的明显摄取，相对荧光强度为53.5。这些结果证实了EGFR-IRDye800CW探针在体外有效靶向EGFR。

Figure 3

作者接着进行了探针在肺癌PDX模型的新鲜组织的体内肿瘤选择性和体外成像研究。体内荧光成像显示EGFR-IRDye800CW探针在肿瘤区域大量积累。荧光信号在探针注射后8 h达到峰值，肿瘤与正常组织信号比(TNR)达到5.25。作为对照，在注射EGFR-IRDye800CW探针24 h前给阻断组荷瘤小鼠注射过量的西妥昔单抗。该组的体内成像显示肿瘤区域荧光信号明显减弱，TNR变小(阻断组TNR最大值为1.5)。其同型对照组的TNR为1.1。以上数据证实了EGFR-IRDye800CW在HCC827肿瘤中的摄取增强，以及EGFR-IRDye800CW探针在体内对肿瘤细胞的靶向能力。器官和肿瘤的体外荧光成像显示，探针主要集中在肝脏、肿瘤组织和脾zang。免疫组化染色显示HCC827肿瘤细胞膜和细胞质中EGFR呈强阳性。这些结果进一步证实了EGFR-IRDye800CW在高表达EGFR的肿瘤中摄取增强。随后，作者构建了肺癌的PDX模型，手术切除肿瘤、肺和瘤周组织，利用上述组织，进行了EGFR靶向探针的孵育成像实验。如Figure 4a所示，肿瘤内NIR-II荧光信号增强，而肺和瘤周组织NIR-II荧光信号明显较弱。免疫组化染色显示肿瘤中EGFR呈强阳性(Figure 4b)。如Figure 4c所示，EGFR-IRDye800CW组肿瘤的相对荧光强度达到126.6，比肺(82.7)高1.5倍，比瘤周组织高1.8倍。同型对照组肿瘤荧光强度甚至低于肺或瘤周组织组。如Figure 4d所示，EGFR-IRDye800CW组肿瘤:肺和肿瘤:瘤周组织的信噪比(SBR)在1.5 ~ 2.1之间。这些结果证实了EGFR-IRDye800CW能够特异性的标记肿瘤区域。

Figure 4

作者随之进行人肺癌样本的体外成像研究。目的是开发一种技术，该技术通过在手术过程中提供病例验证结果(量化边界距离和疑似转移淋巴结的鉴别诊断等)来帮助医学专业人员进行病理诊断，且不会干扰组织的完整性或形态。临床标本为10例根治肺癌患者手术切除的10个肺组织和60个淋巴结，组织病理学分析显示，所有肿瘤均为浸润性腺瘤。染色方案见Scheme 1。切除后，立即将含有可疑肿瘤组织的标本放入含有5%胎牛血清的Krebs-Henseleit 's溶液中，温度为4-8 ℃，然后转移到含有1 mg /mL EGFR-IRDye800CW探针的磷酸盐缓冲盐水溶液中，孵育20 min。孵育结束后，用含30% PEG-400的磷酸盐缓冲生理盐水冲洗3次，每次冲洗1 min。随即用NIR-II荧光成像系统对标本成像，观察荧光强度。作者通过H&E染色和免疫组化结果，验证了该方法应用于人肺癌切除组织鉴别的可行性。此外，该技术还用于验证肺癌患者术中可疑转移淋巴结。证明该技术是一种快速的术中病理检测方法，具有临床应用价值。

Scheme 1

首先是人原发性肿瘤的体外成像研究。手术切除后，新鲜组织立即按照Scheme 1中步骤孵育并成像。Figure 5显示了一例典型的不确定肺结节和包括术前CT扫描在内的多模式成像（Figure 5a）Figure 5b显示了胸腔镜下肿瘤区域的白光图像。手术切除后，切开新鲜组织，暴露肿瘤区域(Figure 5c-d)，用EGFRIRDye800CW孵育并成像。观察到组织的部分区域荧光信号增强，而邻近组织的荧光信号较弱(Figure 5d)。作者使用标准的H&E染色程序确认这些高亮区域为肿瘤组织，并通过免疫组化方法确定EGFR在肿瘤区域高表达。如Figure 5e所示，在荧光图像上进行线分析取样，得到其信号强度；线的信号强度显示出较好的对比，可以勾画出肿瘤。EGFR-IRDye800CW组肿瘤TNR为2.5±1.3。而用IRDye800CW标记的人抗IgG重组抗体scFv片段孵育的同型对照组，其跨界信号强度几乎没有变化。这与之前在动物模型中得到的结果一致，表明EGFR-IRDye800CW可以通过靶向EGFR特异性标记肿瘤细胞。更重要的是，由于肿瘤与正常组织的信号比优越，可以清楚地识别肿瘤边缘。这些结果表明EGFR-IRDye800CW探针可以快速标记和成像肺癌。然后作者评估了此方法是否可以量化边缘距离。使用ImageJ软件对体外荧光图像进行分析，通过先标定1厘米像素的距离，然后测量从荧光信号边缘到短纤维线的距离，量化边缘距离，与术后几天的腔内组织病理学分析报告的边缘进行比较，二者的边缘几乎一致。

此外，作者还通过组织切片的显微分析验证了本文提出的技术的特异性。将肺癌患者肿瘤组织的连续冷冻切片，用EGFR-IRDye800CW培养后，在NIR-II荧光显微镜下观察。肿瘤细胞区域有明亮的荧光信号，通过荧光信号可以区分肿瘤边缘。更重要的是，EGFR免疫组化证实了荧光信号与EGFR的表达一致。以上结果进一步证实了利用荧光标记的抗人EGFR重组抗体scFv片段进行肺癌靶向成像的可行性。术中使用EGFR-IRDye800CW孵育分离组织时，荧光成像可以清晰地将肿瘤与正常肺组织区分开来。在肿瘤组织中观察到荧光信号与EGFR表达的共定位，进一步证明EGFR-IRDye800CW能够特异性靶向和标记肿瘤细胞。

Figure 5

作者接着对人肺癌样本进行淋巴结转移的体外成像研究。术前CT扫描显示可能有淋巴转移(Figure 6a)，但PET/CT未能检测到病灶内高摄取信号。Figure 6b显示手术切除淋巴结的体外成像。作者用手术刀片暴露淋巴结内部后，立即按照Scheme 1的流程对新鲜淋巴结标本进行孵育成像，并分析成像结果。荧光成像结果如Figure 6c所示。与孤立的良性淋巴结相比，转移淋巴结的荧光信号增加3倍。采用标准的H&E染色程序来确定高荧光区域，结果显示这些高亮区域包含肿瘤细胞，并通过EGFR免疫组化，确定这些高亮区域表达了高水平的EGFR。如Figure 6d所示，在荧光图像上绘制兴趣线，得到信号强度；横线信号强度的明显对比显示出淋巴转移灶。EGFR-IRDye800CW组TNR为2.7±1.1。此外，作者对基于EGFR-IRDye800CW的近红外荧光成像的平均荧光强度进行统计分析，发现转移淋巴结的敏感性为77.8%，特异性为92.1%。

Figure 6

讨论：肺癌是世界上最常见的癌症之一，每年造成大量的死亡。近年来，在图像引导的肺癌手术切除中，荧光成像技术得到发展。但受成像探针和成像系统发展的限制，该技术在临床应用中仍面临诸多困难。

本研究证实了利用荧光标记的抗人EGFR重组抗体scFv片段进行肺癌体外快速术中荧光成像的可行性。用EGFR-IRDye800CW孵育离体肺癌组织时，荧光显像可清晰区分肿瘤与正常肺实质。EGFR-IRDye800CW在表达EGFR的肿瘤组织中的特殊定位使肿瘤可见。组织病理学证实荧光信号和EGFR表达在肿瘤组织中共同定位。这些结果表明，在手术中使用荧光标记的抗人EGFR重组抗体scFv片段培养分离组织，对肿瘤边界成像和转移性淋巴结成像是可行的。期望在手术中对肿瘤边界和切除边缘距离给出医学专业意见，如术中冰冻切片可以做到的那样。

在本研究中，作者用EGFR靶向的荧光探针培养新鲜切除的肺组织，并使用NIR-II荧光成像系统可视化肿瘤的位置和边界。将6例患者新鲜切除的肺组织进行体外EGFRIRDye800CW培养，然后用NIR-I/II荧光成像系统成像，分别计算TNR。结果显示，NIR-II成像的平均TNR为3.13±0.48(范围2.43 ~ 3.87)，NIR-I成像的平均TNR为2.24±0.29(范围1.87 ~ 2.63)，NIR-II成像结果的TNR显著高于NIR-I成像结果(P < 0.01)。导致NIR-II荧光成像中TNR较高的主要因素是正常肺组织中荧光强度的降低。

在本研究中，EGFR靶向探针主要用于啮齿动物标本和人肺癌样本的体外成像研究，而非体内成像；由于探针不是静脉注射或在体内局部给药，也就不需要探针的安全性或毒性数据，这为探针的临床快速转译奠定了基础。

术中病理诊断对术中决策至关重要。通常情况下，术中肿瘤的定位取决于医务人员的经验;往往只能得到相对粗糙的肿瘤边界。即使扩大切除范围，仍有一些肿瘤可能被遗漏。阳性切缘和微转移的存在导致8 - 50%的患者肿瘤在术后复发和转移。因此，在术中确定肿瘤边界和发现微转移对实现精确的手术切除非常重要。其他技术，如术中超声技术，肿瘤检测特异性非常高，但其敏感性不足以导致小病变漏诊，且对手术切缘的判断不足；术中MRI (iMRI)可以显著提高神经外科的准确性和安全性，但由于设备复杂，使用成本高，需要在手术室进行特殊改造等，目前还不能推广。

近年来发展了一些新的术中成像技术，如用于肿瘤恶性程度判断的术中拉曼成像和肿瘤边界成像，有报道指出拉曼成像可用于术中快速病理检测，展示出一定的应用潜力，但由于拉曼成像本身信号较弱，其灵敏度有待重新评估。

综上所述，本研究中，作者采用靶向近红外荧光探针在术中培养分离的组织标本，然后使用NIR-II荧光成像系统快速识别切除肺组织中的肿瘤区域，区分肿瘤边界，以及在淋巴结内的转移。值得注意的是，提出的术中快速病理检测技术可以应用于其他需要局部广泛切除的领域(如黑色素瘤、结肠癌、外阴癌)，以解决边缘控制差的问题。

局限性：首先，尽管该研究包括了肺癌位点的几个肿瘤亚位点，并且每个样本使用了许多数据点，但样本量限制了可以得出的结论。其次，由于碳粉沉积在肺组织表面会干扰荧光成像，该技术在吸烟者或严重污染地区的应用可能受到限制。再者，虽然本文通过免疫组化证实了EGFR在肿瘤细胞和正常肺组织中的表达存在显著差异，也证实了超过80%的肺癌患者中EGFR过表达。同时利用该技术，证明了EFGR的表达与荧光强度呈正相关，那么在EGFR低表达的患者中，该技术可能导致假阴性结果。最后，已知肿瘤中EGFR分布不均，肿瘤中EGFR表达的显著不均一性可能会影响肿瘤与正常组织的比值。尽管存在异质性和样本量小的问题，但研究结果表明，本文开发的方法可以用于肿瘤边界的识别。

总结：荧光标记抗体结合术中荧光成像可成功识别肺癌标本的边界，和用于体外转移性淋巴结检测。这项技术有助于在有限的手术时间内做出肿瘤合理切除的决定。

参考文献

doi.org/10.1007/s00259-022-05975-7

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