FISH联用技术揭开微生物的神秘面纱丨FISH与Raman、LIFT技术联用方案-医疗器械网

FISH联用技术揭开微生物的神秘面纱丨FISH与Raman、LIFT技术联用方案

来源：长春长光辰英生物科学仪器有限公司分类：行业标准 2024-04-19 13:15:03 72阅读次数

微生物，这些微小的生物体在我们的环境中无处不在，扮演着至关重要的角色。它们参与了许多关键的生态过程，如物质循环、土壤形成、水质净化等。传统的分离培养方法确实能够揭示被分离微生物的生理生化特性。然而，这类传统的非原位培养会改变微生物群落的生理状态、代谢特性以及与其他微生物的相互作用。该问题在探索环境相关的微生物群落功能过程中会对结果造成一定的影响，因此，有必要应用更为高效和精确的技术来探索环境微生物，特别是未培养的微生物群落。荧光原位杂交技术（FISH）便是其中的佼佼者，它通过与拉曼光谱和LIFT技术的联用，为微生物研究领域带来了革命性的进展。

FISH技术：微生物研究的利器

FISH技术能够在保持细胞形态完整的条件下，检测细胞的核酸序列，并标记核酸/细胞位置。这一技术已经在微生物领域的应用中展现出其不可替代的作用，特别是在生物被膜和环境微生物组成等相关领域的研究中。其在标记分离环境微生物并探究环境菌群组成可视化及代谢机制方面具有不可替代的作用。

FISH的基本原理是通过用已知的DNA/RNA为模板，设计互补的单/双链，并添加非放射性的荧光标签作为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中目标的靶基因进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，进而从群体中快速、准确地识别到目标细胞。

FISH标记原理图

注：图片引自Amann, R., & Fuchs, B. M. (2008). Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology, 6(5), 339-348.

与传统的原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。此外，FISH技术可与共聚焦拉曼光谱（Raman）及可视化单细胞分选等技术联用，实现目标细胞的多维表型检测与单细胞测序等应用。

FISH与拉曼联用：揭示微生物代谢之谜

拉曼光谱作为一种免标记、非侵入的微生物代谢原位检测技术，可以与FISH技术进行联用。这种联用技术在原位建立单个微生物个体代谢表型与基因型的联系，已经在探究微生物生长代谢、环境微生物菌群碳、氮循环等领域被广泛使用。

FISH与LIFT技术联用：精准捕捉目标微生物

基于激光诱导向前转移（LIFT）的单细胞分离技术具有可视化、高精准、低损伤等特点，与FISH技术联用，可以将被标记了特点荧光探针的目标菌准确、高效地筛选出来，进行单细胞测序等下游实验研究。目前FISH常用的荧光素标记包括Cy3，Cy5，GFP，FITC，DAPI等，都可以适用于自主开发的PRECI SCS-F荧光单细胞分选仪，能够在FISH识别的基础上，所见即所得地获得目标荧光菌。

FISH技术在应用中的常见问题

common problem

FISH标记的微生物拉曼光谱能够检测吗？

由于荧光信号强度通常是拉曼信号的106-108倍，因此如果一束激发光同时激发出了样品的荧光和拉曼光谱信号，拉曼信号会被荧光所掩盖，导致无法获取。因此，在探针选择上，其激发波长应尽量避开拉曼检测激光波长。此外，在拉曼检测前，使用激光照射的方法使FISH的荧光信号淬灭，从而显现出样品本身的拉曼信息。

FISH标记有什么局限性吗？

FISH标记在对细菌群落组成探究以及功能基因标记可视化上并没有太多局限，但在后续进行基因组测序过程中可能需要对染料标记的细胞进行额外的处理步骤。因为部分的FISH染料残留物可能会对DNA质量和纯度产生影响，并可能干扰扩增反应。因此，在进行基因组测序之前，可能会需要进行如洗脱染料或纯化DNA等步骤，以确保获得高质量和干净的DNA样品。

荧光单细胞分选仪支持几种FISH荧光标记？

目前的PRECI SCS-F荧光单细胞分选仪搭载4个通道，涉及红黄蓝绿四色染料，标配激发光波长包括紫外光波长、488nm、550nm、650nm，能够涵盖市面上大部分常见的荧光染料，也可根据客户需求进行激发与发射波段的定制。PRECI SCS-F很好地匹配了FISH的多重标记优势，结合智能图像识别算法，可同时根据2-4种FISH荧光标记特征及明场形态学特征对目标微生物进行自动化识别与精准分离，目标菌得率≥99%。

产品链接：PRECI SCS 微生物单细胞分选仪 (qq.com)

应用案例：FISH技术的实际成效

Phosphorus Removal and Storage Polymer Synthesis by Tetrasphaera-Related Bacteria with Different Carbon Sources

《聚磷菌Tetrasphaera在不同碳源下的除磷和聚合物的合成》

利用荧光原位杂交技术(FISH)在污泥样品中，通过不同荧光探针指示各种属的菌；同时结合单细胞拉曼光谱技术（Raman），对聚磷菌Tetrasphaera中多聚磷、糖原和PHA等胞内代谢物进行原位分析，为深入了解的碳来源依赖的代谢及其对全球废水除磷的贡献提供洞察。

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Classification and Identification of Archaea Using Single-Cell Raman Ejection and Artificial Intelligence: Implications for Investigating Uncultivated Microorganisms

《利用单细胞拉曼分选和机器学习对古菌进行分类和鉴定:对未培养微生物研究的启示》

利用拉曼光谱结合荧光原位杂交技术(Raman- FISH)，直接从海水中获取未培养古菌(MGII)和细菌的拉曼光谱。这是首次将Raman-FISH应用于海水中未培养古菌的研究，该研究为研究MGII的脂质组成提供了一个新的视角，并为在单细胞水平上研究和分类原生微生物和其他未培养的自然微生物提供了一个有用的方法。

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Integrated identification of growth pattern and taxon of bacterium in gut microbiota via confocal fluorescence imaging‐oriented single‐cell sequencing

《基于共聚焦荧光成像的单细胞分选测序技术揭示肠道菌群中细菌的分裂模式及种属分类》

该研究利用分子探针活体标记策略，与共聚焦成像及单细菌分选测序相结合，开发了一种无需体外培养即可同时获得单细菌基因信息和生长分裂表型信息的方法，可对共聚焦下呈现特异荧光信息的感兴趣细菌进行直接分选和测序，实现了对复杂细菌样品的“所见即可知”。

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