微生物研究的新视角丨SIP-稳定同位素技术与拉曼光谱的联合应用-医疗器械网

微生物研究的新视角丨SIP-稳定同位素技术与拉曼光谱的联合应用

来源：长春长光辰英生物科学仪器有限公司分类：维修保养 2024-04-26 09:45:08 113阅读次数

近年来，人们对于微生物领域的研究通常从分类和遗传学的角度来考虑它在不同条件下是如何变化。同样的，微生物之间以及微生物与宿主之间的相互作用也可以被理解为元素的交流。这些元素组成了微生物的很多重要结构，也参与代谢和免疫相关的各级流程。目前，同位素示踪剂已广泛应用于环境研究中，用于研究微生物生理生态和养分循环。其中稳定同位素标记（Stable Isotope Probing，SIP）是同位素示踪的常用方法，该方法在使用初期被用于标记DNA或RNA，常见的SIP标记有¹³C、¹⁵N、²H、¹⁸O等。随着非放射性同位素使用范围的扩大和其他蛋白/有机物检测手段的增加，该技术近年来被广泛应用于标记氨基酸、肽段、糖蛋白等有机化合物，进而探究微生物循环相关的代谢机制。

SIP-稳定同位素技术

SIP技术的原理是通过将稳定同位素标记的底物提供给微生物，然后追踪和分离含有稳定同位素的细胞组分，从而确定哪些微生物参与了特定底物的代谢活动。这项技术在环境科学、土壤生态学、微生物生态学等领域中被广泛应用。SIP可以与拉曼光谱、荧光原位杂交（FISH）、基因组学、蛋白质组学、纳米级二次离子质谱（NanoSIMS）等技术联用，在标记微生物种群功能和探究单细胞代谢活性方面起到了不可替代的作用。

SIP-Raman技术

SIP-Raman技术作为一种能够在单细胞层面上检测与识别SIP标记微生物的技术，目前已被广泛应用于微生物的碳、氮代谢循环机制探究，以及部分异养/自养微生物的生长速率的量化检测等。其原理为被SIP标记的微生物个体，在拉曼谱线中会显示出特定峰位强度和频率的变化。例如，将培养基中部分H₂O用D₂O替代，经过短时间培养，具有代谢活性的微生物拉曼光谱中位于2900-3100 cm^-1处的C-H峰，将部分转化为C-D峰并红移至2100-2300 cm^-1附近，通过计算每个微生物个体C-D的相对强度，可以量化表征其代谢活性。

目前，D₂O-Raman技术被广泛应用于耐药菌、极端耐受菌、微生物活性等研究中。其他稳定同位素也可与Raman技术联用，例如，使用¹³C标记底物，可引起有机物降解菌与碳相关的拉曼峰位出现红移，进而实现检测；而¹⁵N-Raman能够实现对固氮菌及参与氮循环的菌株的识别。此外，SIP-Raman还可与FISH、电镜等技术串联使用，实现更多维度的代谢分析。

SIP-Raman-FISH-SEM联用示意图

注：图片引自参考文献Schaible, G. A., (2022). Correlative SIP-FISH-Raman-SEM-NanoSIMS links identity, morphology, biochemistry, and physiology of environmental microbes. ISME Communications, 2(1), 52.

进一步地，SIP-Raman识别到的功能微生物个体，还可以应用基于激光诱导向前转移（LIFT）原理的单细胞可视化分选技术精准分离出来，进行单细胞全基因组扩增与测序，再根据基因序列反向推测目标功能菌。

SIP-稳定同位素技术与拉曼光

谱联合应用中的常见问题

common problem

SIP标记与FISH标记在标记靶向性上有什么区别吗？

SIP标记的原理主要是基于微生物细胞的功能代谢，FISH标记的原理主要是基于微生物基因组上的功能基因序列，二者虽然都是靶向标记，但SIP更偏向于表型标记，FISH更偏向于基因组标记，二者的联合使用可以在一定程度上将微生物基因组与表型进行联合，相互辅佐。

SIP标记过程中需要特别注意什么吗？

SIP标记的过程会因为每个研究目的的不同而发生改变，需要在微生物原生长环境下替换一定比例的底物，举例而言，如果是对于碳代谢的研究，需要将原碳源替换为同种、唯一的、含一定比例的同位素¹³C的碳源，具体的比例要根据微生物对于同位素标记底物的吸收程度以及同位素碳源是否对微生物本身产生负面影响来确定。如果是不可培养的环境微生物，则需要在环境中替换或添加某种底物进行标记。

被¹³C及¹⁵N标记的微生物个体，在拉曼光谱上会显示哪些峰位的偏移？

¹³C标记替代¹²C会导致1001 cm^-1的苯丙氨酸峰红移至966 cm^-1，1578 cm^-1的核酸相关峰红移至1537 cm^-1，1665 cm^-1的酰胺I峰红移至1626 cm^-1处。具体的峰偏移会由于¹³C标记底物和菌的不同有所偏差，但总体峰位相差不会很大。