肺癌是当异常细胞在肺部以不受控制的方式生长时开始的一种癌症。它是一个严重的健康问题，可以导致严重的伤害和死亡,是全世界癌症相关死亡的主要原因，在男性和女性中的死亡率均为最高。目前，靶向治疗是一种以干扰癌变或肿瘤增生所需的特定分子来阻止癌细胞增长的一种药物疗法，对于肿瘤中发现特定基因突变或生物标志物的患者来说，是一种重要的选择。

最近，北京大学基础医学院林志强团队在国际知名期刊Chemical Engineering Journal（IF=15.1）发表一篇题为“An elastase nanocomplex with metal cofactors for enhancement of target protein cleavage activity and synergistic antitumor effect”的文章。该研究借鉴金属离子调节蛋白质功能和活性的方式，采用基于金属辅因子的方法，以胰腺弹性蛋白酶(PPE，ELANE 同系物)为模型药物，增强靶蛋白裂解和抗肿瘤效应。作者体外开发并优 化了一种具有增强裂解活性的弹性蛋白酶纳米复合物(CAEN)，借助玉研肺部雾化给药装置定量靶向给予到小鼠肺部，CAEN阻止了PPE在生物环境中的降解，并有效地将其传递给肿瘤细胞。通过有效裂解跨膜蛋白CD95(与游离PPE相比具有更高的特异性)，CAEN在肺癌细胞中诱导了显著的凋亡。

CAEN主要通过无创雾化吸入进入肺组织，实现肺组织特异性蛋白药物传递(图1)。在肿瘤细胞中，从CAEN释放的PPE与Mn2+嵌合体特异性裂解肿瘤细胞的跨膜蛋白CD95，导致细胞凋亡，而且释放的Mn2+能有效增强肺部肿瘤组织的局部免疫反应。

图1 弹性蛋白酶纳米复合物(CAEN)

由于血液中存在多种丝氨酸蛋白酶，因此在实际应用中可能会抑制PPE的活性。作者为了验证CAEN对血清的敏感性，在不同细胞系中使用了含或不含胎牛血清的培养基进行细胞毒性试验。结果如图2所示。CAEN组在使用含或不含血清培养基进行实验时，均表现出显著的细胞毒性作用。

图2 不同制剂（含或不含血清）处理后的细胞存活率

上述实验表明设计的CAEN能够稳定PPE的活性，防止其受到血清中蛋白酶抑制剂的抑制，达到完全的抗肿瘤效果。这充分说明金属离子的矿化改性策略有望提供一种保护PPE活性的方法，CAEN的生物矿化作用为这类功能蛋白在抗肿瘤治疗中的有效活性提供了纳米屏障。

为了验证不同制剂组裂解CD95的能力，作者纯化了MBP-CD95蛋白并进行切割实验。首先，将不同制备组与MBP-CD95蛋白孵育30min，结果见图3两组之间的差异在于PPE组完全裂解WBP-CD95，而CAEN组仅选择性裂解CD95蛋白。因此，弹性蛋白酶与锰离子的生物矿化复合物可以实现CD95 蛋白的特异性裂解。

图3 不同制剂与MBP-CD95体外切割效果验证

作者在B16-F10肿瘤细胞上进行了细胞凋亡实验。流式细胞术结果显示，CAEN治疗组发生凋亡的肿瘤细胞比例最显著，表明CAEN具有诱导细胞凋亡的能力。

图4 不同制剂凋亡实验细胞仪数据分析

上述实验强调了CAEN裂解靶蛋白的潜力及其抗肿瘤作用。

研究表明，与静脉给药相比，吸入和递送治疗药剂可对局部恶性肿瘤组织实现更好的治疗效果，并降低不相关的全身效应的可能性。在文章中，作者使用玉研仪器公司的肺部雾化给药装置（YAN-30012）对小鼠肺部定量输送CAEN制剂。

为了验证雾化装置能够成功给药，作者使用考马斯亮蓝溶液(CBB)作为指示剂来证明药物可以有效地进入小鼠的肺组织。图5可以观察到小鼠肺组织中有明显量的CBB液，主要均匀分布在气管、支气管。因此，肺部雾化给药有望有效实现纳米粒子的局部递送和组织器官的特异性治疗。

图5 考马斯亮蓝溶液已被雾化吸入

为了检验CAEN在肺部的滞留，作者使用Cy7荧光染料标记的PPE和CAEN进行肺部雾化给药，并取出肺组织用于荧光成像观察。实验结果表明，采用肺部雾化给药方法可使CAEN均匀进入肺组织。

图6 不同制剂（含或不含血清）处理后的细胞存活率

此外，作者还评估了肺部雾化给药后不同制剂在肺组织中的跨粘膜吸收行为。吸入PPE-Cy7和CAEN-Cy7后24小时，处死小鼠，采集肺进行荧光成像。荧光成像如图所示，在用CAEN-Cy7处理的肺中观察到更强和更深的荧光分布，表明矿化纳米颗粒作为载体表现出优异的渗透和保留能力，能够显著改善生物大分子蛋白的跨粘膜通透性和截留率。

图7 各组离体器官和肺组织切片荧光成像结果

上述实验结果表明，与游离蛋白相比，CAEN能提高细胞摄取效率，并延长蛋白在局部组织中的保留时问。

为验证CAEN的抗肿瘤作用，C57BL/6小鼠经尾静脉注射B16-F10细胞，形成肺癌模型。在第5、9、13、17天使用玉研肺部雾化给药装置给小鼠肺部给药，进行局部抗肿瘤治疗。在第5、13和21天，解剖小鼠并收集其肺组织。随后，作者计数了小鼠肺组织中的转移灶（图8）。CAEN组在抗肿瘤治疗期间保持了优异的治疗效果，无明显转移。PPE组出现了明显的转移灶，这可能是由于PPE气雾剂吸入无法有效进入肿瘤细胞，使肺组织表面的弹性纤维降解，促进了肿瘤细胞的转移。

肿瘤组织H&E染色显示（图9），CAEN给药组小鼠组织切片中癌细胞较少，而PBS组和PPE组中癌细胞较多。

图8 小鼠肺部给药示意图

图9 使用PBS、PPE和CAEN治疗的小鼠肺组织图像和肺转移结节数量

图10 肺组织转移灶的H&E染色组织学检查

健康小鼠经同样处理后（图11），发现 PPE处理组对健康小鼠肺组织造成炎性损伤，CAEN处理组和PBS处理组无明显变化。PPE蛋白对肺组织的损伤有利于肿瘤的扩散和转移，这也解释了PPE治疗组小鼠在第21天出现严重肿瘤病变的原因。

图11 未接种肿瘤的小鼠经同样处理后肺组织的H&E染色结果

TUNEL染色（图12）证实CAEN有效诱导细胞凋亡，其中CAEN组CD8+T细胞比例最高，提示其在肺肿瘤组织中有高度浸润，有利于杀伤肿瘤细胞。

图12 各组小鼠肺组织TUNEL和CD8+T细胞染色结果

CAEN可以通过肺部雾化给药实现器官特异性递送，扩大了PPE蛋白的应用范围。在动物实验中，CAEN在锰离子的辅助下，可显著诱导肿瘤细胞凋亡，激活肿瘤组织的局部免疫反应。

猪胰腺弹性蛋白酶(PPE)作为一种新型的抗肿瘤蛋白药物，具有很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。然而，由于其固有的缺陷，PPE在肿瘤治疗中的应用受到限制，在本研究中，作者设计并制备了一种切割活性增强的弹性蛋白酶纳米复合体(CAEN)，该复合体含有Ca2+、PPE及其辅因子(Mn2+)以实现CD95 蛋白的特异性切割。CAEN不仅有效地保护和稳定了PPE蛋白的活性，而且在不同类型的癌细胞中也表现出有效的杀伤作用。通过玉研肺部雾化给药装置，有效实现了纳米粒子CAEN在小鼠肺部的定量精准靶向递送和肺部组织器官的特异性治疗效果。CAEN中金属离子的释放影响了肺部肿瘤细胞的内环境，导致肿瘤细胞内活性氧水平升高和线粒体损伤。结合Mn2+的免疫激活功能，CAEN在体内外均能有效抑制肿瘤细胞的生长，具有良好的生物安全性。总之，该研究为蛋白质药物在抗肿瘤治疗中的应用提供了有效的研究思路。