参照USP<621>修订版进行UHPLC-SEC分析条件转换设定-医疗器械网

参照USP<621>修订版进行UHPLC-SEC分析条件转换设定

来源：东曹（上海）生物科技有限公司分类：技术参数 2023-12-08 11:45:27 96阅读次数

2022年末，USP<621>Chromatography指南的修订版⁽¹⁾生效，日本随之公布了第十八版日本药典第一次增补本⁽²⁾。其内容是将规定了市售医药品通过色谱法等方法进行检测的USP专论，更新为通过超高速、高性能色谱法（UHPLC）进行试验。在将专论试验法转换为UHPLC时，不需要进行重新验证，可在保持以往实验方法的分离性能的同时，实现缩短时间、节省溶剂的成本优势。另外，其内容不仅适用于等度分离，还适用于梯度分离。

本篇推送我们将详细说明在尺寸排阻色谱分析时，根据新版USP<621>的规定从HPLC-SEC到UHPLC-SEC分析条件的转换。

从HPLC-SEC转换为UHPLC-SEC

USP对影响分离的因素，如色谱柱内径(dc)、长度(L)、填料内径(dp)、流速(Fc)等参数做出了更改，不仅以短柱确保了不低于原有检测法的分离性能，还实现了缩短时间、节省溶剂的优势。将与USP（L59）对应的色谱柱TSKgel G3000SWXL（5 μm,HPLC）色谱柱转换为TSKgel UP-SW3000-LS （2 μm,UHPLC）时，流速变化允许范围如下表所示。

*使用2支30 cm (串联2支色谱柱)时, 与30 cm的UHPLC色谱柱相同

**应在不超过色谱柱最大压降的流速下使用

作为参考，如果是串联2支TSKgel G3000SWXL色谱柱、以高分离度为目的的色谱柱体系的质量管理/分析法的情况下，使用30 cm的TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱，也可得到相同的分离效果。

此外，单克隆抗体的分离还可参考USP<129>指南⁽³⁾和相关UHPLC分析例⁽⁴⁾。

从HPLC色谱柱转换为UHPLC色谱柱

图1是分析单克隆抗体时，从30 cm的TSKgel G3000SWXL谱柱转换为15 cm的TSKge UP-SW3000色谱柱的分离谱图。在符合USP规定的分析条件下进行UHPLC分离，在确保分离度为同等以上的同时，分析时间减少了约50%，流动相也减少了约80%。

图1. HPLC-SEC (30 cm色谱柱) 转换为UHPLC-SEC (15 cm色谱柱) 的分离例

在进行质控分析时，为了提高分离度有时会串联2支30 cm的TSKgel G3000SWXL色谱柱进行分析。在这种情况下，可转换为使用30 cm的TSKgel UP-SW3000色谱柱进行UHPLC分析（图2）。

图2.HPLC-SEC (30cm色谱柱×2支) 转换为UHPLC-SEC (30cm色谱柱) 的分离例

梯度分离时从HPLC转换为UHPLC

修订后的USP给出了使用梯度分离的其他色谱分析模式从HPLC转换为UHPLC的规定。进行梯度分离时，需要追加设定梯度体积、梯度坡度等项目。关于复杂的条件设定，由于主要设备制造商的UHPLC系统支持符合USP规定的软件，所以可使用该类软件设定实验方法的条件。

参考文献

1. USP<621>, https://www.usp.org/sites/default/files/usp/document/harmonization/gen-chapter/harmonization-november-2021-m99380.pdf

2. 第十八版日本药典第一次增补本，https://www.mhlw.go.jp/content/11120000/001022457.pdf

3. USP<129>, https://www.usp.org/sites/default/files/usp/document/our-work/biologics/guide-proc-for-recombinant-therapeutic.pdf

4. L.Avagyan et al., Fast and sensitive size exclusion chromatography of IgG antibody, Knauer,Application No.:VBS0066, https://www.knauer.net/Application/application_notes/vbs0066_fast-and-sensitive-SEC-of-IgG-antibody.pdf