干货分享|GlycanPac AXH分析人促红细胞生成素（EPO）的N糖
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史俊霞
糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，唾液酸作为“桥梁”分子附着在聚糖的远端，唾液酸化聚糖表现出广泛的结构多样性，这使他们在不同的生命过程中具有丰富的生物学功能，包括发育、体细胞重编辑和癌症进展。
蛋白药物中，唾液酸对糖蛋白的稳定性和3D构象很重要，并且具有关键性的功能作用。重组人促红细胞生成素（EPO）广泛应用于治疗肾性贫血以及 肿瘤等各种慢性疾病所伴发的贫血。该药物 是一种单链的酸性糖蛋白，分子量为 32000-39000Dar,EPO 的糖基包括 3 个 N2 糖 链（分别位于 Asp 24，Asp 38，Asp 83）和一个 O 糖链（位 于 Ser126）。他们的主要成分是甘露糖，岩藻糖和唾液酸等 [1]。其中，唾液酸在维持 EPO 分子的酸性，阻断细胞表面半乳糖受 体结合，防止 EPO 失活等方面有重要作用 [2]。阴离子交换-亲水相互作用的混合模式GlycanPac AXH柱子，既能将糖链按照唾液酸的数目进行分组，又能根据糖的羟基结构差异进行分离。创新性的解决高唾液酸蛋白糖型分离难题[3] [4]。方案如下：
样品制备
本次样品使用PNG酶酶切后，对比了经典的还原酶切和非还原酶切后使用2AB标记的N-糖链的分离情况，在整个样品制备过程中，过量的标记试剂会干扰糖链，特别是低唾液酸糖链的出峰，所以使用了Hypersep Aminopropyl的氨基小柱进行净化处理。该氨基小柱可以高效地除掉过量的标记试剂，得到优异的糖型分离结果。
GlycanPac AXH UHPLC色谱柱VS GlycanPac AXH HPLC色谱柱分析结果
UHPLC色谱柱更小的粒径能够得到更多的组分信息，特别是高唾液酸含量的EPO N糖，如图（1）和图（2）所示，图（3）和图（4）所示，无论是非还原酶切和还原酶切的样品，Glypac AXH 1.9 μm的UHPLC色谱柱能够将组内的N糖分离的更好，远超过HPLC的结果，两根柱子都可以将N糖分成5组。
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GlycanPac AXH色谱柱下，非还原酶切VS还原酶切重复性对比结果
在多次平行实验过程中，如图（5）和图（6）所示，发现非还原酶切的重现性优于还原 酶切的重现性。
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总 结
阴离子交换-亲水相互作用混合模式的GlycanPac AXH的UHPLC色谱柱，解决了高唾液酸样品在亲水相互作用模式下，分离度不够，不同个数唾液酸修饰的糖链定性难题。对于高唾液酸蛋白分析提供了新的选择。
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引用文献：
[1] D avis J M , A rakaw a T, Strick land T W , et al. Biochemistry, 1987, 26: 2633—2638
[2] Dongm i C, M yungsoo K, Tongsei A. J. Chromatograph. B, 1996, 687: 189—199
[3] 李响， 中国新药杂志，2024，33（6）
[4] GlycanPac AXH-1 Columns Product Manual
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