材料和方法

这一部分介绍了实验中使用的Saccharomyces cerevisiae菌株和培养基。

表格1列出了使用的菌株。除了亲本菌株外，本文还分析了所有PDR12基因拷贝均已删除的菌株。用于开发筛选方法的是利用来自Pichia stipitis的XR和XDH基因整合到基因组中的二倍体工业菌株KE6-12（该菌株源自TMB3400）。使用BioLector验证玉米秸秆水解产物（CSH）。

本文选择了在pH4和存在醋酸的条件下表现良好的一些菌株（LCBM103、LCBM109、LCBM110、LCBM126）进行验证。由于菌株已证明具有高乙醇产量和耐铝性，本文选择了LCBM67和LCBM97。这些菌株在含有10 g/l酵母提取物、20 g/l蛋白胨和20 g/l葡萄糖的酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中保存，并添加20 g/l琼脂制备固体培养基。

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实验条件

使用BioLector微型生物反应器（m2p-Laboratories GmbH，德国）进行水解产物中的菌株生长评估，培养使用MTP梅花板，每个孔1毫升。培养条件设置为1200 rpm、30℃和85%湿度。每20分钟在线测量一组生长情况Biomass值。对于厌氧发酵实验，使用连续通入N₂确保整个微型生物反应器实验保持厌氧条件。液体培养基未脱氧。

摇瓶体系：在250或100毫升摇瓶中，使用50或20毫升培养基，在200 rpm和30℃下摇动，验证了菌株的生长。在摇瓶培养期间多次取样进行光密度测量和HPLC分析。微型生物反应器培养液的组成也在培养结束时进行分析，以了解底物消耗和产物形成情况。所有培养均至少进行两次重复。

在含有乙酸等木质纤维素水解产物中的培养条件下的生长

KE6–12的生长也在100毫升摇瓶中进行了测量（图1b）。在BioLector培养中，与含有80% WSH的培养相比，含有70% WSH的培养的滞后阶段差异很大（图1a），而在摇瓶中却未观察到这种差异（图1b）。可能是因为摇瓶中更好的通气性有助于更好地适应和脱毒。然而，BioLector和摇瓶培养中的生长曲线和条件排序相似，这表明可以使用BioLector平台监测木质纤维素水解产物中的生长。

在BioLector中的适应和发酵

研究表明，酵母的短期适应能够提高对木质纤维素水解产物的耐受性和发酵能力。使用10% WSH进行的短期适应导致了当以OD 1开始生长的培养物在含有80% WSH的培养基中进行好氧培养时，滞后阶段减少了40小时（图1c）。当起始接种量增加到OD 2或OD 4时，KE6–12细胞的滞后阶段缩短了20或35小时，并且对水解产物的短期适应并不影响细胞的生长（图1c）。

为了研究短期适应在厌氧条件下的影响，细胞在0、14或40% WSH中进行了预培养，然后在起始OD为1的情况下接种了含有80% WSH的培养基。未经适应的细胞显示比经适应的细胞生长较慢，分别在16或6小时后开始生长（图1d）。

CSH相对于WSH而言颜色更深且对细胞的抑制作用更强烈（图1e）。我们比较了CR01和KE6–12的性能，并发现短期适应高度依赖于菌株。这项研究使用1毫升BioLector培养再次证明了在200毫升摇瓶培养中观察到的观察结果。

评估木质纤维素水解产物中的不同菌株

图2

(A) 菌株在含有70%小麦秸秆水解液（WSH）的培养基中的好氧培养和(B) 厌氧培养。

实验室菌株以黑色显示，工业菌株以青色显示，野生型分离物以洋红色显示。

在好氧条件下，评估的菌株的滞后阶段在3到22小时之间变化，之后菌株的生长速率在0.04到0.21小时-1之间变化（图2a）。携带木糖利用途径的KE6–12能够利用培养基中的所有木糖和葡萄糖，而其他菌株不利用木糖或仅将其转化为木糖醇。

在好氧条件下，所有LBCM菌株的细胞密度都比Ethanol Red、DGI 342和PE-2高得多（图2a），表明它们在2G生物精炼中具有很大的潜力。

BioLector平台还允许在厌氧条件下监测生长。在厌氧条件下，LBCM菌株和PE-2几乎没有显示任何残余生长，而其他菌株则积累了更高水平的生物质（图2b）。

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