（1） 称取婴儿配方奶粉试样 0.15 g（m₁ ）至 50 mL 离心管中，  加入温水（约 40° C ～ 45° C）至12g，记录加水后的溶液质量（m₂ ）。充分混匀溶解，室温避光放置15min，每隔5min 振摇30s。称取制备后的溶液5g（m₃ ）至50mL带螺 旋盖的离心管中。计算粉末样品质量（m）：m=m₁*m₃/m₂。

（2）称取适量上述溶液试样 5g 于 50mL 离心管中，加入 0.4g 抗坏血酸，6mL BHT- 乙醇溶液（0.2g/100mL），涡旋混匀30s，再加入 3mL 氢氧化钾水溶液（50%，w/w），涡旋混匀后于80?C±2?C条件下涡旋振荡 30min，立即冷却（-18?C 冷冻静置 0.5h），待提取净化。皂化液中加入3mL去离子水，涡旋混匀，取皂化液，在 8000r/min下离心5min。

（3）SPE小柱处理：CNW Poly-Sery PSD 聚苯乙烯二乙烯苯 SPE 小柱（货号：SBEQ-CA3585）

· 活化：6mL 甲醇；

· 平衡：6mL 水；

· 上样：全部上清液转移至固相萃取柱中（流速 <60 滴 / 分钟）；

· 淋洗：用 10mL甲醇- 水混合溶液（1:19，V/V）洗涤离心管，涡旋 30s，在8000r/min下离心 5min，将上清 液一并转移 SPE 小柱上样，重复操作 2 次；

· 洗脱：用 8 mL 乙腈 : 甲醇（1:1，V/V）分 3 次洗脱。

      （4）收集洗脱液，氮吹至 4mL，加水定容至 5mL，过 0.22μm有机相尼龙针式滤器（货号：SCAA-104），取适量滤液进样。

注意事项：

①   前处理过程尽量在避光环境下进行，以减少目标化合物的降解；

②   氢氧化钾水溶液需储存于聚乙烯瓶中;

③   皂化液使用 3 mL 去离子水涡旋混匀后，进行 SPE 净化过程；

④   建议调整上机溶液中有机相比例尽量与初始流动相中有机相比例（83%）相近。

2.1 液相色谱：

a) 色谱柱：Athena C30 液相色谱柱（4.6 * 150 mm，3 μm，货号：LAEQ-461553）；

b) 柱温：25℃;

c) 流速：0.80 mL/min；

d) 进样量：20 μL；

f) 流动相：A：甲醇，B：水；

g) 紫外检测器：检测波长 UV1 为 294 nm，检测波长 UV2 为 325 nm；

h) 荧光检测器：荧光激发波长为 294 nm，发射波长为 328 nm。

表 3-1 液相色谱梯度洗脱条件

图 3-1 混合标准溶液（全反式视黄醇 200 μg/L、13- 顺式视黄醇 80 μg/L，五种生育酚 1.0 μg/mL）谱图

图 3-2 基质空白谱图

图 3-3 基质加标样品 1（全反式视黄醇 200 μg/L、13- 顺式视黄醇 80 μg/L，五种生育酚 1.0 μg/mL）谱图

图 3-4 基质加标样品 2（全反式视黄醇 1000 μg/L、13- 顺式视黄醇 400 μg/L，五种生育酚 5.0 μg/mL）谱图

表 4-1 奶粉基质本底数据

注：① N.D，低于检出限；

       ② GB 2760-2014 食品添加剂使用标准中规定乳化制品中维生素 E 的最大使用量为 0.5g/kg，该实验结果均在限量值范围内， 满足要求。

     表 4-2 奶粉基质两水平加标回收率数据

        使用标准品和相关耗材，维生素 A 和 E 基质加标加标回收率均较好，均在 80%-105% 之间，RSD 均≤ 10%。能够满足婴儿配方奶粉基质中维生素 A 和维生素 E 的检测，达到实验需求。