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抗体片段的纯化策略

来源：Cytiva（思拓凡）分类：招商 2024-05-08 10:15:06 59阅读次数

抗体片段，例如Fab、scFv、Dab、纳米抗体等已经成为抗体药物中非常重要的种类，由于其尺寸较小，更容易穿透组织，可以在疾病的诊断和治疗中发挥独特的作用。有Fc片段的单抗和双抗已经有成熟的纯化平台工艺，大大提高了工艺开发效率。针对抗体片段类型的分子，我们同样也可以建立平台化的纯化策略（见图1），帮助加速药物的开发进程。

图1：抗体片段分子的纯化平台

下面我们介绍一个Fab片段纯化的经典案例供大家参考。该抗体片段的基本性质见下表。

来源				大肠杆菌上清液
分子量				48kDa
等电点				8.5
聚集体含量				3.5%

根据抗体纯化的经典三步法策略，我们也将其纯化工艺分为捕获 (Capture) 、中间纯化 (Intermediate Purification) 、精纯 (Polishing) 三个步骤。每个阶段，都是分辨率、载量和回收率之间的一种平衡。

捕获阶段

在含有Fc片段的抗体纯化中，我们一般选择蛋白A填料来做捕获。那针对没有Fc的抗体片段，可以选择其他的亲和填料，如Mabselect VL（蛋白L）、Protein G Sepharose4FF（蛋白G）、Mabselect VH3（改造后的蛋白A）等等。想要了解各种亲和填料的特点请戳? 抗体亲和填料大赏 | 你“种草”了哪一款

中间纯化阶段

对于第二步的纯化，选择了Capto SP ImpRes这一款具有高分辨的阳离子填料，希望可以有效地去除聚集体。该案例使用了DoE的方式，寻找回收率和聚集体去除的最佳区间。使用上样pH、上样量和线性梯度长度为Factor；其他参数，如保留时间、Wash长度、梯度终点的氯化钠浓度等保持一致，选取优化阶段的CCC响应曲面设计进行实验，结果如图2、图3所示。

图2：回收率的响应曲面图

图3：聚集体的响应曲面图

根据图中显示的结果，在高pH的情况下回收率是比较好；但是对于聚集体的去除，低pH的效果更为显著且与上样量的多少并没有关系。为了寻找到回收率和聚集体去除都满足的空间，我们使用了甜蜜点 (sweet spot) 分析（梯度长度固定为20CV）。在绿色区域范围内，是可以同时满足回收率>90%并且聚集体含量≤1%的条件，而蓝色区域只能满足这其中之一。最后，在绿色区域中，选择上样量50 mg/mL，pH5的单点做验证，结果如图中所示，满足了该步骤对于质量的要求。

图4：梯度长度为20CV下的甜蜜点图

当然，在该案例中，我们使用了Capto SP ImpRes这款填料，如果在工艺中，纯阳离子填料无法满足要求的话，也可以考虑Capto MMC ImpRes这种复合模式的阳离子填料或者高分辨率的疏水填料Capto Phenyl ImpRes或Capto Butyl ImpRes，对产品相关杂质的去除也会有很好的效果。

精纯阶段

在第三步层析中，我们选择了Capto Q这一经典的阴离子纯化填料，对于这类等电点比较高的分子，用流穿模式可以很好地降低杂质水平。依然使用DoE的实验方式，选择上样量、上样PH和保留时间为Factor，回收率和ECP的水平作为Response，选取CCC响应曲面设计进行实验。

图5：使用Capto Q纯化的回收率和ECP去除的响应曲面图

据上图的结果，影响回收率的唯一因素就是上样量，上样量越高，回收率就越高；影响ECP去除的唯一因素是pH，pH越高，ECP的去除效率越高。该步骤中，在pH7.0-7.9的范围内，ECP可降低1.2-1.45倍。

同样地，在该步层析工艺中，除了Capto Q阴离子层析填料外，我们同样可以选择Capto Adhere或者Capto Adhere ImpRes这种复合模式的阴离子层析填料，开发思路和Capto Q一致，也会帮助解决一些Capto Q无法解决的疑难杂症。

在该案例中，三步工艺的回收率为80%以上，聚集体的含量从3.3%降低到了0.8%，ECP的含量从初始料液的400,000 ppm降低到了6 ppm，成功地创建了一个Fab的纯化工艺平台。

总结

综上所述，要建立抗体片段的纯化策略，其基本原理和我们纯化单抗类似，采用CIPP的策略，捕获步骤根据不同的结合位点选择不同的亲和填料；中间纯化可以使用高分辨的阳离子填料走结合洗脱模式，如Capto SP ImpRes 、复合模式的阳离子填料Capto MMC ImpRes或高分辨率的疏水填料Capto Phenyl ImpRes、Capto Butyl ImpRes；在最后的精纯步骤，就可以选择经典的阴离子填料走流穿模式，如Capto Q或者复合模式的阴离子填料如Capto Adhere以及Capto Adhere ImpRes。掌握以上三步，抗体片段纯化，手到擒来！

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