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文献｜使用杆状病毒在细胞中表达和纯化小鼠CRISP4蛋白的三步纯化方案

来源：Cytiva（思拓凡）分类：招商 2024-05-10 10:00:12 41阅读次数

富半胱氨酸分泌蛋白 (CRISPs) 是CAP (CRISP、Antigen 5 and Pathogenesis 1) 超家族蛋白中的一个同名支系。CAP超家族蛋白的成员遍布生物界的各个门类，包括细菌、植物、真菌和动物王国，而CRISPs则只存在于脊椎动物中。

人类拥有三个CRISP基因 (CRISP1-3) ，啮齿类动物拥有四个CRISP基因 (Crisp1-4) 。CRISP在哺乳动物的雄性生殖道中高度表达，也是爬行动物毒液中的成分。CRISPs通常是分泌型蛋白质，其特征是存在一个N端CAP结构域，其中包含四个标志性CAP矩阵 (CAP1-4) 、一个铰链区和一个连接的C端离子通道调控 (ICR) 结构域。CRISPs的相对分子量为27-31 kDa，含有16个绝对保守的半胱氨酸残基，形成8个分子内二硫键。CAP结构域中有6个半胱氨酸残基，形成3个二硫键，形成一个拟活性口袋；铰链区有4个半胱氨酸，形成2个交叉二硫键；ICR结构域中有6个半胱氨酸，形成3个二硫键。二硫键的适当形成对CRISPs的功能至关重要。

在雄性生殖道中，CRISPs几乎在配子发育和成熟的每个阶段都有表达，它们影响精子顶体的发育和功能、精子活力、潜在的受精能力以及免疫系统的保护。在有毒液的爬行动物中，它们的离子通道调节活动已被广泛描述，已知哺乳动物的CRISPs也具有这种活动。

CRISPs的生产

由于CRISPs结构的复杂性，以往生产功能性CRISPs重组体的尝试一直充满挑战。人们曾多次尝试利用细菌和哺乳动物表达系统表达和纯化全长蛋白质。然而，经常出现蛋白产量低、重组蛋白折叠错误或包涵体形式。因此，大量CRISPs的生产一直是确定其功能的重大障碍。因此，需要一种改进的方案来表达和纯化重组小鼠CRISPs。由于杆状病毒表达系统具有更强的生产可溶性和天然折叠蛋白的能力，因此被广泛用于生产哺乳动物蛋白。

在此次研究中，作者利用杆状病毒表达系统生成了大量可溶性、正确折叠且具有生物活性的小鼠附睾CRISP4，纯化方案的总产量为每升表达培养液3.0毫克纯化重组小鼠CRISP4。

实验方法

将无血清昆虫细胞系和需要感染的细胞分别培养于Sf-900 II培养基和无蛋白昆虫细胞培养基中，在27℃下以120 rpm持续震荡。

将小鼠Crisp4基因克隆到pFastBac-SHEK载体的特定位置中，与一个His6-标签、一个柔性连接序列和Crisp4 N端的肠激酶 (EK) 链接位点相接，完成质粒构建。

使用杆状病毒表达系统生成Crisp4 bacmid，再使用Bacmid载体和基因特异性引物，通过菌落PCR进行蓝/白颜色选择和筛选，鉴定出正确整合了Crisp4的Bacmid克隆。

使用质粒纯化试剂盒分离阳性克隆以制备Bacmid DNA，并保存在4 ℃。在Sf-9昆虫细胞中瞬时转染重组bacmid，产生重组杆状病毒，病毒上清液在2×10⁶ Sf-9 cells/ml的低感染倍数 (MOI) 下扩增三轮72小时。重组小鼠CRISP4在培养上清中表达为可溶性分泌蛋白。

为了表达重组蛋白，用扩增的5%（MOI约为5）高滴度重组CRISP4杆状病毒感染2×10⁶ cells/ml先前在无蛋白昆虫培养基中培养的细胞。在27 ℃、120 rpm的轨道摇床上表达48小时。

最后收获培养物，并在4℃下以 5,000 g离心20分钟。保留上清液用于蛋白质纯化，弃去细胞颗粒。

含有重组小鼠CRISP4的细胞上清液经0.8 μm过滤器过滤，浓缩后使用切向流过滤装置以及10 kDa滤膜对磷酸盐缓冲液 (10 mM Na₂HPO₄，500 mM NaCl，pH 7.4) 进行重过滤。

为了尽量减少与填料的非特异性相互作用，在重滤液中添加了咪唑，最终浓度为20 mM。

获得的重滤液经过?KTA系统进行层析以制备，纯化流程如图1所示。

图1：小鼠附睾CRISP4纯化流程示意图

第一步：亲和层析，将重滤液在平衡的Ni-NTA柱上循环三次，以结合His标记的蛋白质。用洗涤缓冲液 (10 mM Na₂HPO₄, 500 mM NaCl, 30 mM imidazole, pH 7.4) 洗涤Ni-NTA柱以去除非特异性结合，并用洗脱缓冲液 (10 mM Na₂HPO₄, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 7.4) 洗脱His标记的蛋白质。

第二步：凝胶过滤层析，将第一步洗脱馏分的样品进行SDS-PAGE分析，根据分子量测定，将含有重组CRISP4的样品富集，用0.2 μm针式滤器过滤以去除聚集物，然后用HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝胶过滤层析 (SEC) 柱纯化。

第三步：离子交换层析，含有CRISP4蛋白的SEC洗脱液在1 mL HiTrap Capto Q ImpRes高性能离子交换柱进一步精纯。

最后，在SDS-PAGE上分析从峰值馏分中洗脱的重组CRISP4蛋白。用离心浓缩器将纯化的CRISP4浓缩并缓冲到pH 7.4的10 mM Na₂HPO₄中。用布拉德福德测定法测定纯化的重组小鼠CRISP4蛋白的蛋白质浓度，并以小的等分试样保存在-80℃。通过SDS-PAGE分析CRISP4制剂的纯度，并使用小鼠CRISP4抗体在Western印迹中确认其身份。最后，使用糖蛋白染色法评估糖基化的存在，并使用圆二色性 (CD) 光谱对纯化后的重组小鼠CRISP4蛋白进行分析结构特征。

结果分析

图2：(A) 重组小鼠CRISP4在HiTrap Q色谱柱上的离子交换色谱 (IEC) 图谱，(B) 对IEC纯化的重组小鼠CRISP4进行SDS-PAGE分析，(C) 还原SDS-PAGE凝胶Western印迹至PVDF，并用His-tag抗体和mCRISP4单克隆抗体免疫印迹。

从离子交换层析收集的组分中观察到一个分离良好的峰值（图2A），SDS-PAGE显示重组小鼠CRISP4蛋白纯度大于95%（图2B）。作者为了验证是否从昆虫细胞培养上清液中表达并纯化了小鼠CRISP4蛋白，对其进行了Western印迹分析。小鼠CRISP4单克隆抗体和His标记抗体识别出了与CRISP4正确大小（约31 kDa）相对应的条带（图2C）。本研究中报告的纯化方案的总产率为每升表达培养液纯化3.0毫克重组小鼠CRISP4。

图3：重组小鼠CRISP4的生化特征，(A) SDS-PAGE后的库马西蓝和糖蛋白染色，(B) 纯化重组CRISP4的远紫外光谱分析。

SDS-PAGE糖蛋白染色显示重组小鼠CRISP4蛋白被糖基化（图3A）。对His6-CRISP4进行的圆二色性 (CD) 光谱分析证实，纯化的重组蛋白具有二级结构。对His6-CRISP4的远紫外光谱扫描显示，平均残基椭圆度在209和222纳米处最小，在~195纳米处最大（图3B）。

结果

在本研究中，作者利用杆状病毒表达系统开发了一种大规模表达和纯化重组小鼠CRISP4的方案。杆状病毒-昆虫细胞表达系统已被广泛用于表达哺乳动物蛋白，因为它能可靠地获得高产且原生折叠的重组蛋白。利用昆虫细胞作为宿主，可溶性重组小鼠CRISP4蛋白被成功表达并分泌到培养基中，从而可以从上清液中收获蛋白质。由于重组蛋白的N端带有His6标记，因此第一个纯化步骤涉及固定金属亲和层析 (IMAC) 。为了进一步获得高度纯化的重组CRISP4，该方案还增加了SEC和IEC两个步骤。由于CRISPs结构复杂而完整，这对其生物活性至关重要，因此作者使用CD光谱分析来验证其结构折叠。分析结果显示了α螺旋蛋白特有的椭圆度最小值，这也符合小鼠CRISP4或任何CAP超家族蛋白的预期结果。

因此，作者确定了一种高产率生产糖基化重组小鼠CRISP4的表达和纯化方案。采用三步纯化方案生产的重组小鼠CRISP4应适用于研究CRISP4对精子特异性离子通道的调控作用或其在生殖技术中的相关性。正在进行的研究表明，向精子中添加重组CRISP4可改变精子的功能，从而表明它已适当折叠并具有生物活性。

产品信息

货号	产品名称	规格
28989333	HiLoad 16/600 Superdex 75 pg	16×600 mm
29400462	HiTrap Capto Q ImpRes	1×1 mL

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参考文献：

Avinash S. Gaikwad, Khai Lee Loh, Anne E. O'Connor, Hugh H. Reid, Moira K. O'Bryan, Expression and purification of recombinant mouse CRISP4 using a baculovirus system, Protein Expression and Purification, Volume 167, 2020, 105543, ISSN 1046-5928, https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.105543.

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