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新药研究 | SCIEX EAD技术确认PROTAC及分子胶药物代谢位点

来源：SCIEX 分类：应用方案 2024-04-03 17:45:10 0阅读次数

背景

靶向蛋白质降解技术（targeted protein degradation，TPD）是一种新型的药物发现策略，其通过调节宿主蛋白降解系统来发挥治疗效果。通过诱导致病靶蛋白的快速降解发挥治疗作用。TPD技术不用重视靶蛋白本身机制，无需竞争位点，结合上就直接将靶蛋白泛素化标记后降解^[1]。它在治疗癌症、传染性、炎症和神经退行性疾病等方面显示出了巨大的潜力，特别是对于那些具有“不可成药”的致病蛋白靶点的疾病。

TPD技术根据作用原理不同又分为PROTAC和分子胶。PROTAC即靶向蛋白降解嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras），是一种利用泛素-蛋白酶系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）对靶蛋白进行降解的药物开发技术。PROTAC一端是结合E3连接酶的配体，另一端是结合细胞内靶蛋白的配体，配体间由连接子连接。PROTAC通过把靶蛋白招募到E3泛素连接酶附近来实现靶蛋白的多泛素化，最后被蛋白酶降解。分子胶是一类小于500Da的小分子，与PROTAC相比，其中两个配体通过灵活的接头连接，该接头可以扭转和转动并允许两种蛋白质接触，相当于重塑E3连接酶受体表面性质，通过向内拉扯两个蛋白，诱导或增强两个蛋白的相互作用力，从而达到降解目标蛋白的目的。

由于TPD的机制特殊，仅需少量给药就可发挥药效，这也给它的安全性和活性评价带来一定难度。药物的代谢产物分析在药物安全性和活性评价过程中起到了至关重要的作用，目前对代谢物的查找主要依赖质谱技术。

高分辨质谱ZenoTOF 7600 系统既含有根据化学键键能强弱产生二级质谱碎片的CID模式，又含有基于低能电子和带电离子相互作用，从而产生更加丰富碎片的EAD模式，可以为药物代谢位点的确认带来巨大的帮助^[2]。近年来TPD技术在新药研发中备受关注，已开发多种PROTAC及分子胶药物的代谢产物鉴定方案，尤其是使用EAD技术进行了关键代谢位点的确认，本文将介绍其中的3种方案。

方案一：利用 ZenoTOF 7600准确鉴定PROTAC药物GNE-987的I相氧化代谢物

GNE-987是一种降解溴结构域蛋白4（BRD4）的PROTAC，由VHL配体、BRD4配体与间隔基团组成，具有皮摩尔级别的BRD4降解活性，所以这也给它的安全性和活性评价带来了一定难度。

本文采用体外肝微粒体孵育的方式制备代谢物样品，通过 ZenoTOF 7600高分辨质谱系统对样品中PROTAC药物GNE-987的I相氧化代谢产物进行定性分析。在本实验中，使用 ZenoTOF 7600系统中的CID碎裂模式结合其特有的EAD碎裂模式对PROTAC药物GNE-987的I相氧化代谢产物的代谢位点进行了确认，为代谢产物结构的准确鉴定提供了理论依据。

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图1. GNE-987单氧化代谢产物的CID和EAD谱图；a图为CID碎裂二级谱，通过二级碎片归属只能确定氧化发生在右侧的碳链上，b图为EAD碎裂二级谱，通过一系列-CH和-CHOH的二级碎片可判断氧化发生位点

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图2. GNE-987双氧化代谢产物的CID和EAD谱图。a图为CID碎裂二级谱，通过二级碎片及精确质量数只能推测为双氧化代谢物。b图为EAD碎裂二级谱，通过一系列-CH和-CHOH的二级碎片可判断两个氧化位点

方案二：利用 ZenoTOF 7600系统进行PROTAC药物ARV-110的代谢产物鉴定

ARV-110是第一款进入临床试验的PROTAC药物，主要靶点是AR（雄激素受体），临床用于治疗转移性去势抵抗前列腺癌。本方法采用 ZenoTOF 7600高分辨系统对肝微粒体孵育方式进行处理的PROTACT药物ARV-110进行代谢产物分析。采用 Molecule Profiler软件进行数据分析，结合ZenoTOF 7600独特的EAD碎裂方式对代谢位点进行预测。

ZenoTOF 7600高分辨系统中的Zeno trap离子阱集功能可进行二级碎片离子的富集从而得到高灵敏度的二级谱图用于低含量代谢物的谱图解析；CID碎裂模式结合EAD碎裂模式可得到更丰富的二级碎片信息，在判断到代谢路径的同时为代谢物结构式的预测及代谢位点的判断提供依据。Molecule Profiler软件可同时处理CID和EAD数据，从大量基质背景中快速提取代谢物的一级和二级质谱峰并自动进行代谢物的结构预测。

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图3. Molecule Profiler软件中的结果查看界面，软件可同时处理CID和EAD数据，并根据二级谱图信息预测代谢物的结构式信息

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图4. RT 5.9 min和RT 6.3 min处两个葡萄糖醛酸化代谢物m/z 495.2446的EAD二级谱图及特征碎片结构归属，图中结构式圈出部分为碎片对应的结构位置，通过EAD中的差异二级碎片分别对两个保留时间的葡萄糖醛酸化代谢位点进行了判断。在CID模式下由于产生的多为丢掉葡萄糖醛酸基团后的碎片因此较难进行具体的代谢位点判断。

方案三：CID和EAD碎裂模式准确鉴定分子胶药物Mezigdomide的氧化代谢产物异构体

分子胶药物Mezigdomide的主要药理作用包括抗炎、免疫调节和抗肿瘤等，临床主要用于治疗风湿性关节炎和红斑狼疮，也可与其他药物联用作为多发性骨髓瘤的辅助用药。

本文使用 ZenoTOF 7600高分辨系统进行数据采集，使用Molecule Profiler软件进行快速分析，找到肝微粒体孵育样本中Mezigdomide的代谢物。ZenoTOF 7600系统中的Zeno trap功能，可以对低丰度的代谢产物二级质谱碎片进行富集，从而提高其二级质谱图的质量；结合CID和EAD碎裂产生的丰富的二级谱图信息对Mezigdomide的两个氧化代谢物进行了准确的代谢位点分析。

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图5. 两个氧化代谢产物的CID谱图与母药的CID图对比。通过与母药对比可判断氧化发生的大致范围，但无法确定具体的代谢位点

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图6. 两个氧化代谢产物的EAD图与CID图的对比。通过EAD中多个特征的二级碎片信息，可较准确的判断具体的氧化位点

总结

药物代谢产物分析是新药研发流程中重要的一环，是决定药物能否上市的关键因素之一，而代谢位点的确认也是代谢产物分析中的难点。ZenoTOF 7600高分辨质谱系统中特有的Zeno trap功能可以对二级质谱碎片进行富集，尤其对于PROTAC及分子胶这类给药量低的药物，通过富集后的高质量二级谱图可进行低含量代谢物分析。ZenoTOF 7600高分辨质谱系统中含有CID和EAD两种碎裂方式，其中新型的EAD碎裂方式在葡萄糖醛酸化、氧化、脱氢及戊二酰胺水解等代谢位点确认方面可以得到关键的二级碎片信息，帮助解决代谢位点分析中的难题。

参考文献

1. Louise M. Sternicki, Jim Nonomiya, Miaomiao Liu, et al. Native Mass Spectrometry for the Study of PROTAC GNE-987-Containing Ternary Complexes [J]. Chem Med Chem, 2021, 16, 1-6.

2. Enhanced drug metabolite identification using collisioninduced dissociation (CID) and electron-activated dissociation (EAD), technical note MKT-29204-A