FastStart DNA聚合酶

数字PCR技术本身有检测灵敏度高的优势，适合用于低频突变、低拷贝样品的检测。但是更高的灵敏度也意味着更大的引入假阳性的风险，这就需要扩增酶具有很好的封闭性能，防止在常温条件下有残留的扩增活性，从而有非特异扩增的风险。目前热启动Taq酶已经广泛应用于分子检测的各个领域，特别是临床分子诊断领域。热启动Taq酶在常温下没有活性，只有经过高温后Taq酶活性才会被激活。相比于传统Taq酶，使用热启动Taq酶能有效避免PCR反应体系中的非特异扩增和引物二聚体的形成（图1）。部提供多种类型的热启动Taq酶适用于数字PCR技术。其中FastStart DNA聚合酶是专为体外诊断生产设计一种化学修饰的热启动酶。当温度低于75℃聚合酶活性关闭，通过95℃加热10分钟可以充分激活聚合酶的活性进行PCR扩增（图1）。化学修饰可以有效的封闭DNA聚合酶的活性，防止非特异性扩增，获得高灵敏度、高特异性和高产率，非常符合数字PCR技术对于低浓度模板准确检测的需求。

图 1：FastStart DNA 聚合酶高特异性以及热启动过程

图片来源：罗氏诊断整理

KAPA3G HotStart DNA聚合酶

除了化学修饰的热启动酶，罗氏诊断还提供适用于数字PCR平台的抗体修饰的KAPA3G HotStart DNA聚合酶。KAPA3G HotStart DNA聚合酶是运用遗传基因工程和生物信息学等技术，在实验室模拟加速野生型DNA聚合酶的进化，经过多次的突变筛选得到性能优异的工程酶（图2）。作为一种抗体修饰的热启动Taq DNA聚合酶，KAPA3G HotStart DNA聚合酶不仅能够有效的减少在使用过程中产生非特异性的扩增，提高检测的灵敏度和准确性；还具有信噪比高、多重PCR扩增性能好、扩增速度快、耐受多种PCR抑制剂等一系列优秀的特点（图3），有助于进一步提升数字PCR检测试剂的性能。

图 2：KAPA3G HotStart DNA聚合酶定向筛选

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图 3：KAPA3G DNA聚合酶和WT聚合酶一秒延伸时间不同长度片段扩增

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虽然数字PCR相比qPCR对抑制剂具有一定的耐受性，但是临床样本通常复杂多样，特别是粪便或者痰液等样本含有大量PCR抑制成份。数字PCR检测试剂中选用耐抑制的扩增酶可以大大的减少PCR抑制剂对酶反应体系的影响，有助于进一步提高其检测的灵敏度。罗氏诊断提供的KAPA3G HotStart DNA聚合酶对大多数常见PCR抑制剂都有很好的耐受性（图4 ）。

图 4：KAPA3G DNA聚合酶对不同PCR抑制剂的耐受性

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AptaTaq DNA聚合酶

罗氏诊断工业原料提供的寡核苷酸适配体修饰的热启动酶AptaTaq DNA聚合酶也适用于数字PCR平台。寡核苷酸适配体-AptaTaq聚合酶是一个可逆的，温度依赖性热启动系统（图5）。适配体修饰的AptaTaq DNA聚合酶无需热启动时间，PCR运行程序可节省热启动时间多达10-15分钟，加快检测进程。另外，适配体相对于抗体对温度变化更不敏感，因此可在更剧烈的温度下保持稳定，保证其对Taq酶的封闭效果。另外，寡核酸适配体可以作为Taq酶的一种稳定剂，极大的增加Taq酶在常温下甚至更高温度下的稳定性（图6）。AptaTaq聚合酶除了具有高灵敏度和高稳定性的特点，本身还具有优秀的多重扩增的性能，适用于多重数字PCR检测试剂开发。

图5：AptaTaq DNA聚合酶热启动过程

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图6：AptaTaq DNA聚合酶新鲜预混液和干燥制剂在 37℃下贮存 2、6 和 16 周后的 PCR 性能

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HawkZ05 Fast DNA聚合酶

HawkZ05 Fast DNA聚合酶，是一种新型依赖寡核苷酸适配体修饰的酶，本身兼具逆转录酶和DNA聚合酶的活性。可以同时用于低浓度DNA和RNA标靶的检测。其中逆转录酶活性具有耐高温的优势，可耐受60℃的高温，对于具有复杂二级结构的RNA模板的检测具有先天的优势。DNA聚合酶的活性为寡核苷酸适配体修饰的热启动酶，热稳定性非常高，可以耐受120小时以内的常温运输，有助于大大降低运输成本。除此之外，HawkZ05 Fast DNA聚合酶对于常见的抑制剂具有良好的耐受性（图7），可以有效的减少假阴性的结果，显著提高检测灵敏度，适用于数字PCR平台。

图6：HawkZ05 Fast DNA聚合酶对常见PCR抑制剂耐受性

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数字PCR反应体系有其特殊性，除了需要保证扩增性能以外还需要考虑扩增试剂与芯片或液滴系统的兼容性。这就要求数字PCR试剂开发过程中，不仅需要评估扩增酶本身的性能，还需要考虑酶保存液中添加物以及酶量对检测体系的影响。罗氏提供的扩增酶保存液中无额外添加保护剂，最大程度的减少扩增试剂对芯    片或液滴系统的影响。另外，罗氏还可以提供高浓度无甘油版本的酶，极少的酶加入量可以进一步减少酶溶液中添加组分（例如甘油）对数字PCR反应体系的影响，也可以提升数字PCR检测试剂体系的优化空间。罗氏提供高浓度的FastStart DNA聚合酶（100 U/μl）、不含甘油的KAPA3G HotStart DNA聚合酶（30 U/μl）、无甘油包装的AptaTaq DNA聚合酶（50 U/μl）以及无甘油一步法酶HawkZ05 Fast DNA 聚合酶（200 U/μl）。另外罗氏还提供高浓度无甘油的逆转录酶：NxtScript RT, conc.（200 U/μl）和NxtScript 2G RT, conc.（500 U/ μl）。高浓度的扩增酶不仅保持了高灵敏度、高信噪比、高特异性等特点，更大程度上为数字PCR检测试剂体系提供更多的优化空间，并且还可用于冻干以节省产品保存和运输成本。

作为一种高灵敏的检测方法，数字PCR检测结果很容易出现假阳性的问题。其中，检测试剂中各个组分引入的DNA或者微生物残留是产生假阳性结果的重要原因。为了避免检测试剂可能导致的假阳性风险，高品质原料的选择尤为重要。这就要求在开发数字PCR试剂过程中原料做好严格的筛选，确保添加的各种原料均没有DNA或者微生物残留。罗氏DNA聚合酶由罗氏CustomBiotech通过ISO 13485认证的制造设施生产，经过广泛测试并可基于需求规模定制化生产。产品严格控制DNA残留含量，细菌真菌残留和Human DNA残留，能够最大限度的减少对于高灵敏检测的干扰。例如KAPA3G HotStart DNA聚合酶 E.coli DNA和Human DNA残留分别控制在100 pg   /mL和15 ng/mL以下，低残留版本的AptaTaq DNA Polymerase LDx会严格控制DNA的残留量低于每20个酶单位1个基因组当量。除此之外，严格的品控流程确保产品具有很好的批间稳定性，保证结果的一致性和可靠性。

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