SEC-MALS高灵敏度分析PEG化抗体片段
将聚乙二醇（PEG）偶联到蛋白质进行共价修饰可改善小分子生物治疗药物的药代动力学行为。PEG化修饰主要通过掩盖生物治疗药物的理化特性（如构象和疏水性）来提高药物的溶解性、增加血清的半衰期、降低蛋白水解的敏感性、减少肾脏的摄取量，从而降低免疫原性，开创药物递送的新前景[1]。
如何完整表征PEG化蛋白样品是主要挑战之一。PEG化是非特异性反应，因此可能存在单PEG化蛋白和多PEG化蛋白。另外，通过评估PEG化蛋白、游离蛋白和游离PEG的量，可确定PEG化效率，优化PEG化的反应条件。
PEG化改变了分子的流体动力学体积，不同PEG化程度的蛋白质可以通过尺寸排阻色谱法进行分离。本应用中，我们使用UHPLC-SEC色谱柱与MALS、UV和RI检测器联用计算了PEG化Fab和scFv样品中单个峰的分子量。使用该方法可测定其偶联度（DOC）、分析生物治疗成品的反应副产物。
图1. SEC-MALS分析PEG化抗体片段
仪 器：VanquishTM UHPLC系统、示差折光(RI)、LenS3 MALS检测器
色谱柱：TSKgel UP-SW2000 (4.6 mmI.D.×30 cm, 2μm)
流动相：100 mmol/L磷酸钠(pH 6.2)+300 mmol/L精氨酸+10%异丙醇
流 速：0.175 mL/min
温 度：25℃
进样量：10 μL
检测器：UV@280 nm；RI和MALS
样 品：20 kDa PEG-Fab、10 kDa PEG-scFv
分析PEG化抗体片段scFv
图2是10 kDa PEG-scFv的UV和RI检测器信号重叠图。框选部分是未反应PEG的信号，PEG无UV响应，但RI相应信号强。
图2. 10 kDa PEG-scFv的RI和UV检测器信号重叠图
通过比较不同峰的RI和UV信号，我们可以确定各个峰的准确组成（两个成分的重量分数），进而确定其对应的折光指数增量值（dn/dc）。
图3是使用SECview对10 kDa PEG-scFv进行成分分析时的结果。各个峰的PEG和scFv重量分数及其对应的dn/dc值见表1。
图3. 10kDa PEG-scFv样品的成分分析 常规校准(CC)
表1. 图3种各个峰的重量分数及对应的dn/dc值
根据获得的dn/dc分布我们计算了10 kDa PEG-scFv样品中多个组分的相对分子量（图4所示）。RI信号显示色谱图（～11.8 min）高分子量区域形成一个双峰，表示PEG化偶联物。峰4和峰3的分子量分别为27 kDa和9.7 kDa，符合未反应的游离scFv和PEG的预期分子量。峰1的分子量为45.1 kDa，对应di-10-PEG-scFv，峰2的分子量为34.4 kDa，对应mono-10-PEG-scFv。
图4. 10 kDa PEG-scFv样品的分子量图
分析PEG化抗体片段Fab
图5. 20 kDa PEG-Fab的RI和UV检测器信号重叠图
图6. 20 kDa PEG-Fab样品的分子量图
SEC-MALS法可用于抗体片段非定向PEG化生成的复杂混合物的表征。将UHPLC色谱柱TSKgel UP-SW2000与LenS3 MALS、UV和RI检测器联用分离样品组分，建立了一种多用途表征方法。该方法可以通过测定单个峰的分子量来确定偶联度。
SECview软件可以简化偶联分析至数分钟内完成。其分析结果有助于优化PEG化反应，从而获得高效、高稳定性的新型生物治疗药物，以及测定成品中的残留杂质。
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本篇应用笔记
参考文献
1. Gupta et al. J CellCommun Signal. 2019 Sep; 13(3); Turecek et al. J Pharm Sci, 2016
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