灵芝是一种重要的药用真菌，被广泛用于膳食补充剂和制药工业。灵芝子实体不同部位灵芝酸(GAs)等活性成分的空间分布和动态积累模式尚不清楚。本研究实验可分为两大部分：

结果表明大部分GAs含量在菌盖显著高于菌柄，其中灵芝酸B等6种组分极显著。GAs在菌盖主要分布于中层的底缘，如灵芝酸A-I和灵芝酸GS-1，GAs在菌盖主要分布于皮壳层和内层，如灵芝酸A-F。灵芝菌柄和菌盖中大部分灵芝酸含量随灵芝发育而逐渐降低。菌柄内GAs由皮壳层逐渐向内层转移，而GAs在菌盖各组织间的分布无明显变化。亚油酸、9-HODE、9-KODE等脂肪酸主要富集开片期和成熟时期。质谱成像结合非靶代谢组分析为药用食用菌活性物质在不同区域的空间分布研究提供了有力的工具。

研究采用非靶向代谢组学分析方法分析灵芝子实体2个区域（菌盖和菌柄）在4个不同成熟阶段（菌蕾期、开片期、成熟期、收获期）的综合代谢产物谱（图1）。考察的参数包括TIC、平均m/z分布、保留时间、代谢物强度分布，有效的样品制备和高质量的原始数据。在用QI软件处理后，生成了一个新的峰值表，其中包含2451个负离子的特征，用于代谢物鉴定。我们使用内部和公共数据库进行分析，初步确定了132种负离子模式的代谢产物，以提供灵芝子实体不同发育阶段两个区域的综合代谢组。大多数代谢产物主要为三萜类、脂肪酸类和甾醇类。来自菌柄三个成熟期的代谢组被归为同一簇，表明这些样本之间的相似性很高(图2A)。采用化学计量学方法定量灵芝中代谢物的丰度，使用PCA和OPLS-DA分析灵芝不同成熟期的菌盖和菌柄之间的代谢差异(图2B和C)，并且每个区域不同成熟期的代谢物聚在一起，使菌盖和菌柄相互分离。本研究检测了菌柄和菌盖之间的差异代谢物，发现菌盖的代谢物含量显著高于菌柄。这些结果表明，灵芝子实体发育成熟过程中，三萜类相关代谢产物的积累具有组织特异性和阶段特异性。

图1. 灵芝的四个不同成熟阶段。

图2. 灵芝的非靶向代谢组学和统计学分析结果(A)灵芝组织中代谢物丰度热图。(B)灵芝不同成熟期的主成分分析;(C)灵芝不同成熟期的OPLS-DA分析;(D)灵芝菌柄与其他部位的OPLS-DA分析;(E) OPLS-DA分析显示了菌柄和其他区域之间的代谢物谱差异。

串联质谱是一种用于小分子定性和定量分析的强大分析技术。液质高分辨系统不仅能提供准确的定性信息，而且能在极低浓度下准确定量分析物。本研究采用目标性定量分析方法，准确表征不同成熟期灵芝菌盖和菌柄中GAs的分布特征。根据所需保留时间、准确质量、MS/MS光谱片段离子以及与化学标准的比较，我们从灵芝中确定了18种三萜类化合物(图3)。它们可通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪（UPLC-Q-TOF-MS/MS，Waters SYNAPT系统）定量（图4）。

图3. 灵芝三萜类18种GAs的总离子流谱图。

图4. 灵芝不同成熟时期化合物含量变化的折线图。

代谢组学研究结果表明，灵芝在4个发育阶段均存在多种灵芝酸代谢物，而这些代谢物的丰度在成熟期更为丰富。结合代谢组学和DESI-MSI，可以获得丰富、可视化的灵芝不同部位不同成熟期GAs生物合成和积累的空间分布。通过对DESI喷雾溶剂的优化，获得更好的电离和成像效果。在灵芝不同成熟期共观察到14种参与GAs生物合成途径的代谢物，包括灵芝酸A-I、灵芝酸GS-1、灵芝酸N和灵芝酸A- B。图5为灵芝不同部位不同成熟期GAs主要代谢物的空间信息。

图5. 基于LC-MS的代谢组学结合DESI成像对灵芝不同成熟期不同组织切面中GAs的空间代谢组学进行研究。

菌蕾期是灵芝的第一个生长阶段，在此阶段，我们观察到6种灵芝酸分布在皮壳层中，它们可能有助于调节菌群，保护灵芝免受根部周围的非生物胁迫。在开片期，我们观察到，GAs主要集中在皮壳层和内层的木质，两层的代谢物含量存在差异。此外，在成熟过程中，菌柄中GAs的分布规律一致，在内层部分有明显的积累，而在皮壳层中没有观察到GAs的积累。灵芝菌柄发育过程中，GAs的分布逐渐从外向内转移，这可能与次生代谢物的组织间运动有关。

蘑菇富含脂肪酸(FAs)，约占其干重的6-8%。脂肪酸对人体营养至关重要，其有益作用具有改善身体活动和身体代谢率的能力。脂肪酸不仅是必需的营养成分，而且通过其受体对各种细胞活动的贡献也很重要。图7为4个不同成熟期灵芝菌盖和菌柄切片中部分FAs和三萜的离子图像。在这项工作中，我们证明了DESI MSI可以用于可视化FAs和三萜中主要化合物的积累位点。

图6. 基于LC-MS的代谢组学结合DESI成像对灵芝不同成熟期不同组织中GAs和三萜类化合物的空间代谢组学进行了研究。

亚油酸是一种必需的营养代谢物，具有多种生物活性，如修复脂质屏障、抗氧化活性、促进伤口愈合和介导生物过程等。通过成像研究发现，亚油酸在菌蕾期分布于菌柄的皮壳层和内层，而在菌蕾期主要分布在皮壳层和内层的基部。随着灵芝的不断发育，在成熟期和收获期，亚油酸主要集中在内层。从菌蕾期到收获期，我们观察到了亚油酸空间分布的动态变化。由于灵芝皮壳层的上层可能比下层和中层受到更多的光照射，光强的差异可能足以影响亚油酸的形成。另外，本研究还发现了灵芝中有机酸和杂环三萜等离子的组织特异性分布。因此，代谢组学和DESI-MSI的强大方法可以根据小分子的生物合成途径探索和预测其空间分布，从而有助于推断代谢与遗传信息之间的关系。

本研究将LC-MS代谢组学和DESI-MSI相结合，结合高灵敏度和可视化的优势，获得了灵芝4个不同成熟期不同区域的详细空间和化学信息。通过代谢组学初步鉴定出142种代谢物，为可视化分析提供代谢指导。对18个化合物的定量分析结果表明，各成熟阶段和各组织类型内GAs的主要积累模式具有相关性，但随着发育而发生变化。高质量的灵芝GAs离子成像为研究灵芝代谢产物的生物合成、运输和积累提供了重要信息，并可直接追踪灵芝体内三萜的积累过程。此外，还首次可视化了参与FAs代谢的主要代谢物和其他成分，证明了成像技术在植物代谢物研究中的潜力。综上所述，成像技术将有助于从空间角度了解灵芝次生代谢产物，从而更好地了解灵芝有益成分和药用成分的位置，更好地利用灵芝子实体中有价值的部分。

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