Dr.赛流式小课堂 | 流式脾脏样本制备
提到小鼠流式脾脏样本制备,相信很多同学们都会不以为意。想当初Dr.赛在做博士生的时候,经手脾脏无数,自认为经(Ye)验(Lang)丰(Zi)富(Da),对这个问题也会嗤之以鼻,这有什么难的??这还能出什么问题??今天Dr.赛就带着同学们来捋一捋那些年我们掉过的坑,看看这里面有没有你熟悉的坑!
总体来说,脾脏样本制备共分以下四步:
第一步,摘取脾脏
第一次做实验,没找到脾脏的同学,请默默举起你的小手!小鼠的脾脏位于腹腔左上方,紧靠胃底部的左侧,红紫色,呈长条形(图1和图2)。
腹腔打开之后,可以使用镊子将脾脏摘取出来,新手建议使用弯头镊子,不容易刺穿脾脏。脾脏取出来之后,置于RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640基础培养基 + 10%胎牛血清 + 1%丙酮酸钠)备用。如果分离的脾脏细胞还需要培养,可以考虑在完全培养基中添加双抗,降低细胞污染的可能。
图1. 小鼠淋巴结和脾脏分布示意图。
图片出处:Toribio-Fernandez R, Zorita V, Herrero-Fernandez B, Gonzalez-Granado JM. An In Vivo Mouse Model to Measure Na?ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J Vis Exp. 2018 Aug 22;(138):58118. doi: 10.3791/58118.
图2. 脾脏在培养基中的示意图。
图片出处:Harada Y, Miyamoto K, Sujino T. Protocol to isolate and enrich mouse splenic naive CD4+ T cells for in vitro CD4+CD8αα+ cell induction. STAR Protoc. 2022 Dec 16;3(4):101728. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101728.
第二步,处理脾脏
处理脾脏最常用的是机械解离的方法,主要的方式就是研磨。具体来说,将70微米细胞筛网放在 50 mL离心管上方,将脾脏转移到细胞筛网中,使用注射器柱塞端,捣碎或压碎脾脏,使其通过筛网,然后使用移液器吹打均匀,得到脾脏细胞悬液。文献中还有使用酶消化的方式来进行脾脏细胞解离,对于某些特定细胞类型,比如树突状细胞,酶消化的方式能够改善树突状细胞的释放和得率。
第三步,裂解红细胞
小鼠脾脏中含有约2.5-5×1010 红细胞,而白细胞只有约1×108。为了减少红细胞对于白细胞分析可能产生的影响,通常会选择使用红细胞裂解液将红细胞去除。比较常用的红细胞裂解液是以氯化铵为主要成分,通过改变渗透压,将红细胞涨破。
Dr.赛将脾脏细胞水平离心收集(400×g,5分钟)并重悬于5 mL的红细胞裂解液中(eBioscience? 1X 红细胞裂解液,货号: 00-4333-57),冰上孵育4-5分钟,终止反应后,细胞通过离心收集,重悬于RPMI 1640完全培养基。
这里列出了Invitrogen eBioscience常用的红细胞裂解液产品:
红细胞裂解过程中的常见问题:
总是会残留少量红细胞,是否需要裂解完全?
红细胞裂解完全通常是不必要的,一方面少量残留红细胞通常不会干扰后续实验,并且可以在流式分析过程中被分析出来。另一方面,完全裂解红细胞往往需要延长裂红时间,增加裂红次数等,这样可能会对白细胞造成一定的影响。如果确实需要进一步去除红细胞,可以再次用红细胞裂解液孵育样本进行二次裂红。
红细胞裂解离心后,发现有一团细胞,
无法吹打分散,这是怎么回事?
这是红细胞裂解后比较常见的现象,这一团细胞以死细胞为主,细胞死亡造成核酸释放,而核酸比较“粘”,从而形成细胞团。裂红离心之后,需要过滤去除细胞团。如果不去除的话,可能会形成“滚雪球”效应,粘附的细胞越来越多,细胞团也就越来越大。
红细胞裂解液是无菌的吗?
这要看具体的产品,非无菌的裂解液可以自行过滤除菌(0.2微米滤膜),也可以选择无菌过滤的ACK裂解液,货号A1049201。
第四步,细胞计数
裂过红的脾脏细胞中以T和B淋巴细胞为主,个头又小,数量又多,人工计数实在是有点困难。现在,Dr.赛使用的是Countess? 3 FL自动细胞计数器进行细胞计数,又快又准,省时省力。
小鼠脾脏样本制备的常见问题:
小鼠脾脏中有黑斑,是不是小鼠生病了,
这个脾脏还能不能用了?
以Dr.赛本人的经验来看,有黑斑和没有黑斑的脾脏,没有发现有明显的细胞组成变化。同时,Dr.赛也查阅了很多相关文献,目前认为,黑斑是由于黑色素沉积造成的,对免疫学研究未发现有显著影响,无需过多担心。
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