Dr.赛流式小课堂 | 小鼠骨髓细胞分离-医疗器械网

Dr.赛流式小课堂 | 小鼠骨髓细胞分离

来源：赛默飞世尔科技生命科学产品分类：招商 2024-05-10 09:45:14 65阅读次数

在上一期，我们一起了解过在流式样本制备中，如何获得小鼠脾脏样本。点击下方图片，回顾上节课知识点！

点击图片，查看往期Dr.赛流式小课堂小鼠脾脏样本制备知识

骨髓是造血的场所，可分离出红细胞、粒细胞、单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞和造血干细胞等血源性细胞[1]。此外，骨髓也可以作为充质干细胞的来源[2]。分离后的骨髓细胞应用非常广泛，例如直接用于骨髓移植，流式细胞术分析造血干细胞亚群以及各淋巴细胞亚群，或者进行巨噬细胞极化、树突状细胞分化等。那么接下来我们和Dr 赛一起看看怎么得到小鼠骨髓细胞吧！

实验材料

细胞培养皿
75% 酒精
RPMI 1640完全培养基（胎牛血清：终浓度 10%；L-Glutamine：终浓度2 mM；可选：1% v/v青霉素-链霉素。）
灭菌的眼科剪和镊子（或刀片）
1-3 mL 注射器（无菌）
25 号针头（无菌）
无菌70 μm 细胞筛网
无菌50 mL 离心管
红细胞（RBC）裂解缓冲液：如果非无菌，建议通过0.22um滤膜除菌
Invitrogen Countess 3 FL 自动细胞计数仪
磷酸盐缓冲液（PBS）

实验步骤

Part Ⅰ 获取股骨

1. 处死小鼠后，用75%酒精充分消毒，在无菌条件下分离小鼠股骨，股骨是位于膝关节与骨盆胯关节之间的长骨（请参考图一）。

2. 在剥离时，请在骨盆跨关节上方剪下大腿，并在在膝关节下方可活动处剪下股骨下端。注意剥离过程中不要破坏股骨两端关节（请参考图二至图三）。

3. 使用无菌的剪刀，镊子剪掉骨头上的肌肉和纤维组织，整个操作过程留意不要破坏关节或者骨头。可用剪刀刮除骨头表面的肌肉获得如图四所示的股骨。

4. 为获得更多骨髓细胞，可用上述相似的方法获取胫骨内骨髓细胞。

左右滑动查看更多

Part II 收集骨髓细胞

5. 可将完整的骨头置于培养皿中，使用75%酒精清洗1-2min，再放入含有无菌PBS的培养皿中洗掉酒精。

6. 将 70 μm 细胞筛网置于 50 mL 离心管顶部。

7. 用无菌的眼科剪剪断股骨的两端关节，暴露出骨髓腔（请参考图五），将 25 号针头装在注射器上。用注射器抽吸5 mL左右完全培养基。

8. 用镊子将骨头直立于筛网上方，再用注射器小心将骨髓冲出来（请参考图六）。必要时，重复冲洗，当骨头呈白色则表明已冲出所有骨髓（请参考图七）。对所有骨头重复该步骤。

9. 如果剪掉的股骨关节较大，可进一步用剪刀将其剪碎，并用1mL移液器冲洗。

10. 使用注射器的柱塞（请勿触摸柱塞的黑色橡胶；保持无菌），向下用力顺/逆时针捣碎细胞筛网中的骨髓（请参考图八）。确认骨髓均被捣碎，没有块状。

11. 用 RPMI 完全培养基将柱塞端剩下的骨髓冲到筛网中，尽可能多地收集骨髓。

12. 用完全培养基冲洗筛网。取下筛网，盖上盖子。在 4°C 下 600 x g 离心细胞 4 分钟。丢弃上清液（请参考图九）。

左右滑动查看更多

13. 加入 5 mL 左右的完全培养基重悬细胞，上下吹打。可重新过筛，获取单细胞悬液。

Dr.赛友情提示：这一步红细胞还未裂解，如果需要计数建议使用AO/PI 荧光法计数有核细胞哦。推荐大家使用赛默飞的ReadyCount? Green/Red Viability Stain （cat# A49905）搭配Countess 3FL，此试剂中AO和PI两种荧光染料的比例经过优化，可以快捷准确地反映死活细胞的数量。

14. 用适当的培养基将细胞重悬，使达到所需的细胞浓度。

15. 根据下游的应用决定是否需要裂解红细胞或者直接进行培养、分析等（红细胞裂解后也可以利用台盼蓝或AO/PI染色后进行计数哦）。

Question & Answer

问

为什么我分离得到的骨髓细胞很少呢？

答

在剥离骨头和肌肉时，股骨的两端关节一定要完整保留，若是剪破，可能会导致细胞损失；其次，剪下的关节可进一步剪碎，股骨一定要充分冲洗直至苍白；最后收集的骨髓在过筛时可以再进行研磨。当然，如果需要尽量多的骨髓细胞，也可以再分离胫骨和肱骨内的骨髓细胞，其步骤与上述相似哦。此外，也要使用健康的小鼠进行实验。

问

为什么我获取的骨髓细胞会出现微生物污染呢？

答

小鼠处死后，请充分为小鼠皮毛和身体灭菌。获得完整的股骨后，也可以使其浸泡与酒精中进一步消毒，实验用到的眼科剪和镊子均需要灭菌。若还是不放心，可以在培养基中添加一定的抗生素。

问

我获得的骨髓细胞是否必须裂解红细胞呢？

答

这个问题需要根据自己的下游实验来参考文献；例如如果需要培养获取MSC, 可以不裂解直接培养；如果需要利用骨髓中单核细胞分化成为巨噬或者树突状细胞，一般需要裂红（可以使用货号为00-4333-57的理解液，注意使用前需要过滤除菌）。有一些特殊情况，如骨髓粒细胞分离，为了不激活粒细胞，则需要用特殊的裂解方式结合密度梯度离心的方法，可以看看文献【3】哦。

问

我该用多大周龄的小鼠分离骨髓细胞呢？获取的细胞数量在什么数量级是正常的呢？

答

一般使用成年小鼠进行实验，至少需要大于6周。如果有特殊的疾病模型，则需要进一步参考文献并结合实验摸索。文献报道，对于C57BL/6 这个品系的小鼠，收集两根股骨并裂解红细胞后，约有10⁷-10⁸个骨髓细胞。当然，不同周龄、品系和模型在数量上还会有差异的。

参考文献：

[1] Immune Cell Isolation from Mouse Femur Bone Marrow

[2] An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow

[3] Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

这里还有流式染色细胞表面课程

点击小程序，开始学习流式细胞表面染色课程

文末互动

活动时间：2024.5.9-2024.5.15

在评论区留言分享

在流式实验样本制备的经历和故事

我们将于活动结束后2周内

挑选留言最走心的10位

送出赛默飞流式冰箱贴2个

流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器到抗体和试剂的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。