KTA蛋白层析系统延迟体积的确定与设置
?KTA蛋白层析系统的流路自身包含一定管路体积，这部分管路体积又称为延迟体积。延迟体积依据位置不同可以分为梯度延迟体积和收集延迟体积，本文将对以上两种延迟体积定义、延迟体积确定方法和UNICORN系统中延迟体积的设置进行详细介绍。
梯度延迟体积（Gradient delay volume）
梯度延迟体积是指设置梯度程序时混合池与层析柱入口之间的体积，这部分管路体积会导致层析柱中真实梯度与程序中的梯度 (%B curve) 出现一定的延迟（图1）。梯度延迟体积可以通过理论计算和实验测定的方法获得，在使用特定混合器的层析系统中梯度延迟体积是一个定值，不会随着使用层析柱体积大小发生改变。对于离子交换等通过拉梯度方式进行洗脱的层析方法，进行梯度优化时尤其要注意，样品洗脱峰对应B%浓度，是此时混合池正在混合的梯度，并非样品被洗脱当时进入柱子的B%盐浓度。此时，可以用开始给混合池梯度命令（绿色线起点）和电导检测器检测到电导值开始增加（蓝色线起点）之间的体积差，近似作为梯度延迟体积，用于倒推样品洗脱时对应的B%浓度。
图1. 真实梯度（蓝色）对比程序梯度（绿色）
收集延迟体积（Fraction delay volume）
?KTA系统收集延迟体积指UV检测器到样品收集器或者UV检测器与outlet之间管路的体积（图2）。
图2. 蛋白层析系统?KTA系统延迟示意图
?KTA蛋白层析系统收集样品时，需要在系统中准确设置收集延迟体积，从而避免因为收集延迟体积错误，造成?KTA紫外峰图显示的样品出峰位置与对应的收集管发生错位的现象（图3）。图3中（a）图没有收集设置延迟体积导致SDS-PAGE胶图与UV峰图相比出现滞后现象；而（b）图中准确设置收集延迟体积，SDS-PAGE胶图与UV峰图可以较好的进行对应[1]。
图3. 系统延迟体积设置对收集位置的影响[1]
收集延迟体积确定方法
系统延迟体积可以通过理论计算和实验测定的方法进行确定，以下将对两种延迟体积确定方法分别进行介绍。
收集延迟体积理论计算方法
理论计算是获得延迟体积较简便方便的方法，延迟体积理论计算包括以下3个步骤：
1
确定设备系统流路中所有成分部件。
2
查表确定系统流路中各个硬件单元（?KTA pure User Manual 9.14章节）和单位长度管路对应体积（表1）。
3
计算系统延迟体积：将混合池体积与连接层析柱管路体积相加即获得梯度延迟体积；将UV检测器样品流通池的1/2体积（UV检测器检测点为流通池中心区域）与流路中其它硬件与管路的体积进行加和，得到收集延迟体积。
表1. ?KTA系统不同内径管路应用及单位长度管路内部体积
收集延迟体积的实验测定方法
UV吸收值测定法
连接F9-R和F9-T收集器的?KTA pure系统（图3）可以通过UV吸收值测定的方法得到，通过测定V1（样品入口与UV检测器之间体积）、V2（样品入口到收集器样品出口端之间的体积），计算V2-V1+1/2V（V为UV检测器流通池体积）获得延迟体积[2][3]。具体实验步骤如下：
1
设置系统流速1 ml/min（如果流速不准确，检查系统泵是否进气，继续实验前确定流速的准确性）。
2
使用1%-5%丙酮溶液充满样品环（例：样品体积100 μl）。
3
设置UV检测器到收集器之间所有部件为bypass模式。
4
用水充满系统管路，设置流速1 ml/min，用样品环中丙酮溶液为样品上样。
5
计算从样品注入点开始到层析图谱紫外吸收最高点流路体积，即为V1。
6
重新配置系统流路，将收集器置于UV检测器之前。断开UV检测器两端管路，用死体积较小的连接头将两端管路连接起来。收集器出口管路连入UV检测器，UV检测器出口端接入废液口Waste。
7
设置一个较大的收集体积（比如100 ml），保证实验过程中样品从收集口流出。
8
设置流速1 ml/min，加入样品丙酮溶液。
9
计算从样品注入点开始到层析图谱紫外吸收最高点流路体积，即为V2。
10
依据公式计算V2-V1+1/2V（V为UV检测器流通池体积），获得延迟体积。
图4. （A） ?KTA pure蛋白层析系统（B）F9-R收集器（C）F9-T收集器
称重法
通过称量水的重量测定收集延迟体积（容器重量需要预先称重）[3]。
1
设置系统流路从UV流通池直接流向收集器。
2
用鲁尔接头替换UV检测器入口接管。
3
用注射器将UV流通池到收集器尖端整个管路用水充满。
4
使用注射器用空气将UV流通池到收集器尖端整个管路中的水完全替换出来。
5
通过称量水的重量测定收集延迟体积。
6
重复3次实验取平均值。
标准配置的?KTA pure收集延迟体积
标准配置、使用标准长度管路的?KTA pure设备，其设备标准延迟体积数据已在?KTA pure使用手册中列出。手册中延迟体积数据是依据U9-M紫外检测器计算，如果使用U9-L紫外检测器需要在此体积基础上加9μl （2mm流通池）、4μl（5mm流通池）。
标准配置?KTA pure Micro/Micro kit配置微量紫外检测器、微量电导检测器和微量出口阀。
标准配置的?KTA pure系统可以通过查询对应表格（表2、表3和表4）得到标准配置设备收集延迟体积信息。
其他型号标准配置的?KTA蛋白层析系统也可以通过查询使用手册获得设备标准收集延迟体积。
表2. ?KTA pure25收集延迟体积
表3. ?KTA pure Micro/Micro kit收集延迟体积
表4. ?KTA pure 150收集延迟体积
UNICORN系统中收集延迟体积的设置
UNICORN系统中可以设置UV检测器到Outlet阀及UV检测器到收集器之间的延迟体积（图4），具体设置步骤如下：
1
在System Control界面选择System-Settings，打开System Settings对话框。
2
点击 Fraction collection →Delay volumes。
3
在Detector-Frac 中输入UV检测器到收集器之间的延迟体积数值；在 Detector – Outlet中输入UV检测器到出口阀之间的延迟体积数值。
图4. UNICORN系统延迟体积的设置界面
需要说明的是不同型号的?KTA蛋白层析系统延迟体积的确定和设置方法，操作细节上可能存在细微差别，具体设置方法可以查看对应型号产品的使用手册。
参考文献：
1. 芦亚菲. 《蛋白质制备与鉴定平台蛋白层析系统介绍》清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质制备与鉴定平台 2020/05/16 https://phoenix.tsinghua.edu.cn/index.php?c=show&id=519
2. ?KTA pure User Manual 29119969 AE
3. ?KTA Laboratory-scale Chromatography Systems CY13989-02Dec20-HB. Appendix 3 Determination of delay volumes
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