本文要点：研发用于深层组织协同光疗的近红外（NIR）小分子光敏剂是具有挑战性的。本文首先报道了一种利用受体工程策略的无重原子NIR半菁基光敏剂（BHcy）用于808 nm光介导的协同光动力疗法/光热疗法（PDT/PTT）的抗ai治疗。这种策略赋予BHcy更平面、更强大的π共轭结构，导致770/915-1200nm处的长NIR吸收/发射以及单线态氧（1O2）的能力和光热效应的增强，这是由于激发单重态/三重态的能级降低和促进系统间交叉过程。值得注意的是，基于BHcy的纳米颗粒(BHcy-NPs)具有高效的1O2吸收率(12.9%)和高光热转换效率(55.1%)。更重要的是，BHcy-NPs在单次照射后，能够通过破坏主要细胞器显著杀伤癌细胞，抑制肿瘤在体内生长。总之，本研究为设计新的无重原子PDT/PTT制剂提供了一种策略，可用于潜在的临床应用。

背景：肿瘤光疗主要包括光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT），因其无创、高选择性、低耐药性和实时诊断等特点，近年来受到广泛关注，已成为原位肿瘤消融的高效治疗方法。在光照射下，PDT利用光敏剂产生细胞毒性活性氧（ROS）以诱导细胞凋亡，而PTT则使用光热剂产生强烈的热量以杀死癌细胞。然而，单个PDT或PTT通常不足以有效用于癌症治疗，因为肿瘤微环境中具有严重的缺氧性质和丰富的热休克蛋白。因此，PDT和PTT的组合被认为可以达到“1+1>2”的治疗效果。然而，联合光疗的一般方法是使用两个单独的PDT和PTT分子，可能需要不同的激光并导致复杂的治疗。仍然需要开发具有高ROS和光热产生能力的光敏分子，进一步改善协同PDT和PTT治疗。

迄今为止，PDT的几种光敏剂，如原卟啉IX，氯蛋白e6和亚甲蓝，已被临床批准用于治疗皮肤，食管和肺部肿瘤。然而，这些光敏剂的主要吸收光谱仍然位于可见光区域<700nm，由于生物组织内的强烈光吸收和散射，这在很大程度上削弱了深部组织中的治疗效果。在700-1000nm的生物透明窗口中，近红外光显示出更深的身体穿透力和最小的组织吸收，因此，最近人们非常关注开发用于深度PDT处理的近红外光敏剂，包括硼二吡咯甲烷（BODIPY）分子，菁衍生物，金属-有机配合物，和聚集诱导发射（AIE）化合物。然而，这些BODIPY和金属有机配合物通常含有重原子，如I，Br，Ru和Ir，以促进1O2的生成，导致明显的暗毒性，低荧光，以及冗长的合成。此外，BODIPY基光敏剂的光热转换效率（PCE）普遍较低。对于菁衍生物，尽管在近红外区域吸收较强且PCE良好，低1O2生产能力和低光稳定性限制了它们在协同PDT/PTT处理中的进一步应用。例如，吲哚菁绿（ICG）显示在水溶液中近红外光照射下的1O2量子产率低（0.2%）和光稳定性差。这些基于AIE的光敏剂通常表现出良好的效果1O2聚集状态下的量子产率和明亮的荧光，而由于畸变的构象，它们的吸收光谱低于700nm，并且在NIR激发下PCE受损。虽然取得了很大的进步，但在单一光敏剂中同时控制良好的1O2 生成能力、高PCE、超过700 nm的长波长吸收和低暗毒性仍然具有挑战性。

采用的策略之一，以实现两者的高效1O2生成和NIR吸收/发射是在单个分子中引入强供体（D）和受体（A）部分以构建共轭D-A结构，可以降低最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）分布的能级，进一步减小T1(∆ES-T)和的最低激发态单态(S1)与三重态(∆ES-T)之间的能量差，半菁染料具有典型的D-π-A结构，消光系数高、斯托克斯位移大、生物相容性好、修饰合成容易等特点，广泛应用于近红外荧光生物成像和疾病诊断。不幸的是，半胱氨酸染料的1O2产生效率（ΦΔ）极低。总是将重原子引入其中以促进系统间交叉（ISC）过程并进一步增加ΦΔ,而这种结构设计不可避免地增加了暗细胞毒性，和短的三联寿命。没有可行的策略来构建没有重原子的治疗诊断PDT/PTT半菁基光敏剂。另一方面，由于吸收波长短，这些半菁基光敏剂通常使用660或700nm激光照射。然而，400nm和700nm之间的可见光具有更高的组织散射、吸水性和自发荧光，导致体内研究受到损害。由于808nm光在癌症光疗中的激发效果更好，因为它的组织穿透深度相对较深，正常组织和水的吸收较低，如何进一步扩展半菁的吸收/发射并使其适用于808nm激光激发仍然未知，在很大程度上尚未探索。

为了应对这些挑战，作者团队首次报告了一种受体工程策略，以构建无重原子NIR半菁染料（BHcy），用于在808nm光照射下协同PDT和PTT癌症治疗（图1）。通过调节受体单元的电子和空间位阻特性，BHcy在770/915nm处表现出红移吸收/发射，1O2生产能力强，光热性能高。与具有NIR-I荧光（700-900 nm）的传统半菁染料（Hcy）不同，在915 nm处观察到强烈的NIR-II荧光，尾部发射至1200 nm，这将进一步改善组织穿透深度和成像引导治疗。此外，Bhcy在145nm显示出的较大的斯托克斯位移和出色的光稳定性。理论计算表明，BHcy比Hcy具有更好的平面度和更大的π共轭，可以显著减小HOMO/LUMO和S1/T2，并进一步促进自旋轨道耦合（SOC）和ISC过程，从而使近红外吸收延长并使1O2生成增强。值得注意的是，BHcy（BHcy-NPs）的纳米颗粒在水溶液中显示出有效的1O2 生产（ΦΔ= 12.9%）和55.1%的高PCE。更重要的是，BHcy-NPs能够在808nm激光激发下通过协同PDT/PTT治疗显著抑制体内癌细胞和4T1乳腺肿瘤的生长。

图1

结果：BHcy的设计与合成：虽然传统的半菁染料如Hcy表现出良好的近红外光学性能，但其ROS和光热产生能力较差，限制了它们作为癌症治疗的光敏剂。为了获得一种用于协同PDT/PTT光疗的无重原子半菁基光敏剂，作者团队用1-乙基苯并（c，d）碘的平面部分代替了Hcy的受体单元，然后生成了具有更平面和更大的π共轭D-A结构的BHcy，这可能会减小∆E的能量差距S-T，促进ISC工艺，提高量子产率1O2 。另一方面，其更平面的骨架也会在深海中改变吸收波长并增加分子间π-π相互作用，从而在近红外光照射下增强光热效应。BHcy和Hcy的半菁染料是通过Knoevenagel缩合反应直接合成的。

BHcy的光物理性质：作者团队首先在DMSO中测量了Hcy和BHcy的吸收和发射光谱。如图2a，b所示，Hcy在629/681 nm处表现出两个吸收峰，在710 nm处表现出最大的荧光发射。相比之下，BHcy在700/770nm处表现出红移吸收峰，在915 nm处表现出最大的NIR荧光发射，斯托克斯位移增大至145nm，这是由于更强的D-A相互作用和更大的π共轭结构。此外，BHcy还显示出NIR-II尾部发射到1200nm，表明其在NIR-II荧光成像引导治疗方面的高前景（图2b）。此外，作者还比较了Hcy和BHcy在水溶液中的吸收/发射波长。Hcy在水中的吸收和发射分别位于614/668和704 nm，而BHcy在637/755 nm处显示出吸收峰，在910 nm处显示出荧光发射峰。为了评估Hcy和BHcy的光热性能，作者测量了它们在不同激光照射下在水中的温度升高。当暴露于808nm激光照射10分钟时，BHcy溶液（50 μm）的温度显著升高，而Hcy溶液（50μm）的温度在650nm激光照射后仅略有升高（图2c）。计算出BHcy和Hcy的光热转换效率（η）分别为42.2%和6.5%，表明BHcy可以作为良好的光热剂。为了进一步调查BHcy的1O2生成能力，1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）用作1O2捕手，其415 nm处的特征吸收在感应后会减少1O2的生成。在808 nm光照射下，DPBF在415 nm处的吸光度在0-300 s的时间内急剧下降，显示出BHcy生产的1O2（图2e），虽然没有明显的1O2 在 650 和 808 nm 光照射下观察到 Hcy 的产生（图2d，f;）。此外，1O2 基于DPBF的衰减率，BHcy的生产效率比Hcy高9倍（图2f）。这些结果表明，BHcy作为808 nm激光刺激的无重原子光敏剂具有巨大的潜力。

图2

理论计算：为了深入了解Hcy和BHcy的电子激发和光物理性质，开展了密度泛函理论（DFT）和时相关DFT（TD-DFT）的研究。优化的几何形状、HOMO 和 LUMO 分布如图3a所示。Hcy表现出高度扭曲的构象，供体和受体单元之间的扭转角为44°，而BHcy表现出较小的分子主链扭转角（12°）。BHcy的平面结构可能会增强水溶液中分子间π-π相互作用，从而获得更好的光热性能。此外，与Hcy相比，BHcy在整个D-π-A骨架上显示出离域的HOMO和LUMO分布，显示出较小的HOMO−LUMO带隙，为1.91 eV，这与红移吸收非常匹配（图3a，c）。为了进一步研究在ROS生产中起关键作用的ISC工艺，ΔES-T接下来计算SOC值。较小的ΔES-T是，SOC 越大，越高1O2的生产效率。如图3b，c所示，Hcy显示出较大的ΔES1-T11.35 eV，小的SOC 为 0.13 cm−1及其 S1能级低于T2，导致ISC工艺不可行，量子产率低1O2。尽管BHcy表现出类似的ΔES1-T11.34 eV，其 ΔES1-T2仅为0.05eV，大的SOC为0.35 cm−1，可以显着加速ISC过程并促进1O2的量子产率。因此，受体工程策略赋予BHcy更好的平面度和更大的π共轭，从而在长近红外吸收波长下具有优异的PDT/PTT性能。

图3

BHcy-NPs的制备与表征：为了提高BHcy在体外和体内研究中的生物相容性，BHcy进一步与DSPE-PEG共同组装。形成了纳米颗粒，称为BHcy-NPs（图4a）。BHcy-NPs表现出≈10 nm的均匀直径和基于动态光散射（DLS）分析和TEM分析的球形形态（图4b）。与BHcy相比，BHcy在水中的吸收峰为637/755 nm，BHcy-NPs在682/774 nm处显示出吸收峰，并有轻微的浴色位移（图4c）。SOSG是一种单线态氧特异性探针，用于检查BHcy-NPs在水溶液中的1O2生成能力，一旦与530 nm反应，在530 nm处显示绿色荧光1O2.如图4d所示，在808 nm光照射下，含有BHcy-NPs和SOSG的水溶液在530 nm处观察到明显的荧光强度增加，表明BHcy-NPs具有良好的1O2生成能力。据计算，水中BHcy-NPs的1O2量子产率为12.9%，比ICG（0.2%）高65倍。相比之下，没有明显的1O2观察到Hcy-NPs的产生（图4e）。随后，通过监测808 nm激光照射下温度升高（ΔT）来评价BHcy-NPs的光热性能。如图4f所示，BHcy-NPs的光热性能高度依赖于浓度和激光功率，随着浓度从10μm增加到50μm，ΔT从12.5升高到40.2 °C（图4f），30 μmBHcy-NPs的温度显著升高，通过将激光功率从0.75提高到1.5W，ΔT从19.0升高到33.5°C。然后，基于加热-冷却实验循环计算了BHcy-NPs的光热转换效率（PCE）。如图4g，h所示，30μmBHcy-NPs溶液的温度在808 nm激光照射下升高至50.3°C10 min，PCE（η）高达55.1%，高于大多数报道的近红外花菁染料。此外，BHcy-NPs在5次加热-冷却循环后仍保持良好的光热转换能力，并且在连续激光照射10分钟后表现出较好的光稳定性（图4i）。

图4

细胞ROS产生及光损伤机制：在确认了BHcy-NPs优异的PDT/PTT特性后，作者接下来将BHcy-NPs应用于体外光疗研究。首先，使用CCK-8测定在HeLa细胞中进行细胞活力测定。如图5a所示，BHcy和BHcy-NPs在0至30μ m的浓度下均显示出可忽略不计的细胞毒性，表明暗细胞毒性较低。在808nm激光照射5分钟后，观察到BHcy-NPs处理细胞的剂量依赖性光毒性，导致20μ m浓度下≈80%的细胞死亡。为了进一步评估协同PDT / PTT抗ai治疗，作者分别研究了PDT和PTT的疗效，其中HeLa细胞与BHcy-NPs一起孵育30分钟，并用808nm激光在冰上进行PDT治疗或用N-乙酰半胱氨酸（NAC，一种ROS清除剂）预处理以进行PTT测试。BHcy-NPs在协同PDT/PTT治疗中表现出很强的光毒性，例如，单个PDT和PTT分别导致46%和50%的细胞死亡，而PDT和PTT联合导致90%的细胞死亡（30 μmBHcy-NPs）。此外，808nm激光器本身没有细胞毒性（图5a）。进一步验证细胞内1O2 辐照下生成2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯作为ROS指示剂，可用绿色荧光氧化成2′，7′-二氯荧光素。如图5b所示，激光或BHcy-NPs处理的细胞未观察到荧光。相比之下，在照射下与BHcy-NPs一起孵育的HepG2细胞表现出强烈的绿色荧光，这意味着产生1O2 。

图5

其次，通过共聚焦荧光成像研究了BHcy-NPs的协同PDT/PTT抗ai能力，并进行活/死细胞染色实验，直观地区分钙黄绿素-AM染色的活细胞和碘化丙啶染色的死细胞（红色荧光）。如图5c所示，对于808nm激光或BHcy-NPs处理的HepG2细胞，仅观察到绿色荧光。相比之下，“PDT + PTT” 组明显观察到强烈的红色荧光，而单个PDT或PTT组则同时出现绿色和红色荧光。这些结果表明，协同PDT/PTT处理比单独使用PDT或PTT可以达到更好的细胞杀伤效果，这与图5a中的结果一致。为了进一步研究光诱导细胞毒性的机制，作者接下来检查了治疗前后关键细胞器的变化，包括线粒体和溶酶体（图5d）。仅对于激光或BHcy-NPs处理的细胞，清楚地观察到细胞的正常形态。然而，在激光照射下检测到用BHcy-NPs孵育的细胞的膜起泡。此外，线粒体和溶酶体追踪器的绿色荧光几乎在整个细胞质中扩散，表明“BHcy-NPs+激光”组的溶酶体和线粒体都被破坏。为了进一步探索线粒体功能障碍，作者应用JC-1染色来评估线粒体膜电位，在正常线粒体中显示J-聚集体的红色荧光，在异常线粒体中显示J-单体的绿色荧光。与仅具有红色荧光的“PBS+ L”和“BHcy-NPs”组相比，用BHcy-NPs和激光处理的HepG2细胞观察到强烈的绿色荧光，表明BHcy-NPs可以在808nm激光照射下诱导线粒体膜去极化（图5e）。

近红外-II引导内BHcy-NPs的抗ai治疗：在体外优异的PDT / PTT效果的鼓舞下，作者接下来评估了BHcy-NPs在体内的抗ai功效（图6a）。首先将BHcy-NPs溶液注射到4T1荷瘤BALB/c小鼠中，然后进行NIR-II荧光成像。强烈的NIR-II荧光迅速出现，并且在注射后1小时观察到最高的荧光强度（图6b）。因此，在注射BHcy-NPs1 h后进行协同PDT/PTT光疗。接下来，将4T1荷瘤小鼠随机分为三组：PBS + Laser，仅BHcy-NPs和BHcy-NPs + Laser。注射PBS或BHcy-NPs（0.5mg kg）后−1，500μm，30μL），将肿瘤暴露于808 nm激光（0.25Wcm−2）和体内光热图像由热像仪监测。与“PBS+激光”组相比，“BHcy-NPs+激光”组的肿瘤温度在用808nm光照射10分钟后迅速升高至55°C（图6c）。光疗后，每两天测量并记录小鼠的数码照片，肿瘤体积和体重，以评估抗ai效果。“PBS+Laser”和“BHcy-NPs”组显示出快速的肿瘤生长，而对于用“BHcy-NPs + Laser”治疗的小鼠，肿瘤生长受到显着抑制，并且在治疗过程中两个肿瘤完全消融（图6d，e）。为了进一步确认体内光疗效果，使用苏木精和伊红（H&E）染色分析和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL）测定检查切除的肿瘤切片（图6g）。对照组肿瘤细胞排列密集，形态正常，“BHcy-NPs+激光”组明显坏死。此外，在用BHcy-NPs和808nm激光治疗的肿瘤中检测到大量具有绿色荧光的凋亡细胞。此外，还研究了BHcy-NPs的生物安全性。没有观察到体重减轻（图6f），在包括心脏，肝脏，脾zang，肺和肾脏在内的主要器官中没有检测到明显的异常或器官损伤。这些结果表明，BHcy-NPs有望作为一种安全的治疗诊断药物，用于体内协同PDT/PTT对抗ai症。

图6

结论：综上所述，作者成功设计合成了一种无重原子半菁基近红外光敏剂（BHcy）用于PDT/PTT协同抗ai治疗。通过受体工程策略，具有更平面和更大的π共轭结构的BHcy在770/915 nm处表现出红移NIR吸收/发射，NIR-II尾部发射至1200 nm，促进了ISC过程并提高了光热性能。BHcy可以与DSPE-PEG2000 组装形成均匀纳米粒子（BHcy-NPs），其具有良好的量子产率1O2（12.9%）和高光热转换效率（55.1%）。值得注意的是， BHcy-NPs在808 nm激光照射下在体外和体内均具有优异的抗ai效果，这种设计策略将为开发用于癌症光疗的高性能新型PDT/PTT药物提供独到见解。

参考文献

DOI: 10.1002/smll.202204851

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