清洁的艺术：亲和填料的清洁与寿命延长-医疗器械网

清洁的艺术：亲和填料的清洁与寿命延长

来源：Cytiva（思拓凡）分类：技术参数 2024-05-13 09:30:09 0阅读次数

Protein A亲和填料是目前抗体纯化领域中重要的一步层析步骤，与离子/疏水层析不同的是，因其可以快速高效的捕获目标蛋白，往往都是纯化的第一步捕获步骤，因其配基通常为Protein A， Protein A填料在寿命验证过程中更容易发生接近寿命终点时出现载量或者收率降低而停止寿命验证的情况，本文旨在分析Protein A填料的清洁工艺与填料寿命的关系。

寿命次数未达目标次数有可能由两种情况导致：

Protein A配基在纯化过程中发生脱落；

Protein A配基在纯化过程中被杂质占据而无法捕获目标蛋白。

造成填料配基脱落有多种原因：

细胞培养过程添加还原剂等成分，导致细胞澄清液中同样含有还原剂，在上样过程中，还原剂作用在Protein A填料上导致配基发生脱落；而的Protein A填料会在法规监管文件中提供常见试剂的耐受度，如下表1^[1]，避免因试剂使用不当而导致配基脱落；

填料清洁过度也可能导致Protein A配基降解或脱落，当DBC曲线斜率数值变大，可以看做是由于清洁过度导致填料配基发生降解或者脱落，目标蛋白与填料之间传质速率不变或者增大而发生载量降低的现象产生^[2]；使用高浓度碱液进行CIP同样容易带了一些不利影响，如清洗后抗体需要更低的pH才能洗脱下来，一种可能的解释是谷氨酰胺和天冬酰胺残基在Protein A配基上脱酰胺成谷氨酸和天冬氨酸，在中性pH下的结合会受到Protein A配基中新产生的负电荷的影响，导致观察到的亲和力/结合力降低。此外，脱酰胺配体需要较低的pH值才能完全质子化，从而不带电，发生洗脱^[2]。

表1：Chemicals for resistance test of Mabselect PrismA

图1：清洁过度与层析表现关系图

造成填料配基污染有多种原因：

不同种类Protein A填料使用同一CIP条件，耐受高浓度碱清洗的Protein A因其配基通常设计高载量、高耐碱性，如果没有很好的进行清洁，填料容易出现污染从而配基效率降低的问题；

细胞发酵液来料复杂，样品不稳定易降解或聚集，杂质含量高；

寿命验证过程中，清洁工艺未设计定期高浓度碱处理操作；（如图2）所示，在寿命验证过程中，当DBC曲线斜率数值变小，可以看做是由于清洁不足导致填料上污染物积累，目标蛋白与填料之间传质速率下降，导致载量下降^[3]；目前关于填料污染的机理推测是因为当mAb分子与Protein A配体结合时，一部分mAb分子发生构象变化，从而暴露mAb分子表面的疏水性斑块。亲脂蛋白与这些单克隆抗体分子结合。在洗脱过程中，这些复合物中的大多数从Protein A配体中分离出来，部分重新折叠为天然形式，部分在低 pH 值和高局部浓度的综合条件下在树脂上和树脂内部沉淀。一旦形成，除非通过更加严苛的清洁条件去除，否则这些沉淀物会因循环此时增加而不断累计最终导致加速寿命衰减^[4]。

图2：清洁不足与层析表现关系图

图3：Proposed fouling mechanism of MabSelect resin by mAb A

填料污染影响的主要是基架内部的孔隙率，对于填料粒径、外水体积以及柱效都没有影响^[3]。颗粒间空隙（外水体积）比颗粒内空隙大，在流速冲刷下，并没有大量积累杂质。表2^[3]内数据表明，颗粒内孔隙受到污垢的影响而下降，并且污垢可能阻塞这些孔隙，从而降低了这些孔隙中存在的配体对单抗的可及性。

表2：Comparison of key mass transfer parameters for the fresh resin and fouled resins generated from the cycling studies performed with and without feed material

不同的清洁工艺开发条件也将影响着填料寿命次数，填料清洁工艺开发需要在填料兼容性的基础上，考虑清洁工艺对微生物灭活效率的研究与填料清洁效率研究，而在法规监管文件中与《生物负载：当前解决下游生物工艺中微生物污染的创新与实践》中有填料兼容性与微生物灭活效率相关数据支持。而不同清洁条件对填料清洁效率的研究，如同下图4^[5]中案例所示，为了提高填料相容性，降低NaOH浓度是首选。然而，较低的NaOH浓度溶液可能无法为微生物控制提供足够的填料消毒，或者有效的填料清洗。所以需要在清洁工艺开发初期，结合填料相关资料与平台经验，确定一个合适的清洁工艺条件。

图4：Resin compatibility study

在选择合适的清洁工艺条件后，在寿命验证中，合适的验证方案与适当增加的清洁方案对于Protein A填料寿命的延长都有一定程度的促进作用。如图5^[6]中的案例所示，在寿命验证过程中，每5-10cycle进行blank run及final cleaning，可以有效的延长因填料污染导致寿命衰减的情况。

图5：The 24 h automated life cycle study strategy

2017年上市的MabSelect PrismA，耐受0.5-1M NaOH，并且配基长度、密度以及基架孔径和孔隙率等均经过优化，具有高耐碱性和大于80 g/L的高载量，可以满足清洁工艺开发与寿命验证过程中使用高浓度碱处理，保证配基上杂质被去除干净且不会因高浓度碱处理导致配基发生脱落，另外MabSelect PrismA同样具有优秀的压力流速曲线，可以在放大生产规模上有良好的层析表现，保证抗体工艺的稳健生产。

图6：Mabselect PrismA高载量与高耐碱性

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《生物负载：当前解决下游生物工艺中微生物污染的创新与实践》

参考文献：

[1]. Regulatory Support File of Mabselect PrismA

[2]. Lingg N, Daxbacher A, Womser-Matlschweiger D, Pum D, Beck J, Hahn R. Alkaline treatment enhances mass transfer in Protein A affinity chromatography. J Chromatogr A. 2022;1673:463058. doi:10.1016/j.chroma.2022.463058

[3]. Pathak,Mili,Rathore,et al.Mechanistic understanding of fouling of protein A chromatography resin[J].Journal of chromatography, A: Including electrophoresis and other separation methods, 2016, 1459:78-88.

[4]. Zhang S , Daniels W , Salm J ,et al.Nature of foulants and fouling mechanism in the Protein A MabSelect resin cycled in a monoclonal antibody purification process[J].Biotechnology and Bioengineering, 2015.DOI:10.1002/bit.25706.

[5]. Zhou T, Wang L, Zhang Z, Jin M. An enhanced regeneration strategy to improve microbial control and prolong resin lifetime for Protein A resin in large-scale monoclonal antibody (mAb) purification. J Biotechnol. 2019;289:118-125. doi:10.1016/j.jbiotec.2018.11.022

[6]. Wang L , Dembecki J , Jaffe N E ,et al.A safe, effective, and facility compatible cleaning in place procedure for affinity resin in large-scale monoclonal antibody purification[J].Journal of Chromatography A, 2013, 1308:86-95.DOI:10.1016/j.chroma.2013.07.096.

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