宽场显微成像通常是活细胞成像的首选，因为它能够更快、更温和地成像。最先进的宽场显微成像使用 LED 光源和滤光片组。尽管有很多滤光片都可以用于各种不同的荧光团组合，但是为了获得用多个荧光团标记的样本的正确图像，需要考虑多个因素。

大多数用于活细胞成像的荧光团都具有宽发射光谱。这一事实通常意味着各个探测通道之间会出现串扰现象，例如，您会在红色探测通道中看到来自绿色通道的一些发射光。在活细胞成像实验中使用多个标记时，荧光光谱重叠现象很常见，因此为了确保看到想识别的细节，可以使用窄带滤光片。但是，这种方法会导致灵敏度下降并影响结果，因为活细胞中的荧光团信号水平通常较低，尤其是对于靶标丰度稀疏的样本或以内源性水平表达的样本。使用更多激发光来抵消灵敏度下降通常不可行，因为这种方法对样本的危害性会增加（即光毒性增加）。

在活细胞实验中，高速采集通常至关重要，特别是在研究快速动态过程时，如囊泡观察。使用滤光片会导致速度受限，因为在改变每种颜色的滤光片组时必须依次成像。按顺序采集图像比同时采集图像需要更多时间，因此在采集过程中可能会错过样本的快速运动，因为从一个图像到下一个图像时每种颜色都有更长的时间间隔。此外，当两种或多种颜色之间的直接比较至关重要时，例如在上述囊泡观察实验中：信号甚至可能在两次荧光团采集之间已经移动，从而加大数据解释的难度。

研究活细胞中多个探针之间的相互作用而获得的大量信息可提供生理学方面更重要的结果，因此人们开发了多种方法来拆分复杂的混合发射光信号。

为了能够使用多个标签，以便从一个样本中获得更深入的认识，您可以使用光谱图像信息线性拆分方法，它可以分析每个荧光团对总信号的贡献。要进行线性光谱拆分，必须为所有可能的参考光谱混合方式计算未知光谱与参考光谱之间的最小差值 ⁽¹⁾。这种方法通常用于对多种颜色成像，即使它们重叠。但是在宽场显微成像中，您仍可能遗漏关键信息，因为必须对样本中每个荧光团依次成像，这会导致速度受限。

有一种方法可以快速拆分多种颜色，而不必担心采集期间光谱重叠，也无需学习复杂的光谱拆分方法。

最近发表的一些文章介绍了一种基于相量的光谱拆分方法 ^{(2, 3)}。光谱相量分析可将每个像素的光谱成分转换为二维图中的一个位置。这样就可以利用简单的数学方法即时、可靠地分离不同染料的发射光。此外，它还可以仅基于光谱而不是强度来增加滤光——从而保留图像的细微细节，同时减少可能会影响线性光谱拆分的噪声。由于实际上消除了串扰以及自发荧光等干扰因素，选择合适的荧光探针组合不再是问题，因此以这种方式成像可以更轻松地设置多通道活细胞成像实验。