在过去几年中，脂质纳米颗粒（LNPs）已被发现是 RNA 传递的有效载体，有多个传染病和癌症治疗的临床试验可证实。以 mRNA 为载体的疫苗对于治疗严重疾病如严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的成功一定程度上可归功于开发了包含 mRNA 的 LNPs 以实现有效的细胞内传递。本文探讨了喷雾干燥工艺作为冻干以外的另一种脱水过程，可以提高 LNPs 的稳定性并提供可替代的给药途径。

RNA 疫苗的挑战

疫苗液体配方的稳定性问题可能成为其工业化和分销的障碍。高温可能会影响疫苗的稳定性因此，通常需要冷链系统来保持疫苗的活性。mRNA 储存过程中的化学不稳定性包括 N-糖苷键的水解、磷酸二酯键的水解、胞嘧啶衍生物的脱氨和核碱基或糖部分的氧化。然而，当疫苗转化为干粉时，可获得更强的热稳定性和更长的保质期。

利用冻干技术制备 RNA 疫苗

冻干或冷冻干燥是干燥疫苗最常用的方法，处理过程由三部分组成：

较高的冷冻温度、较慢的冷冻速率和较长的次级干燥时间都有利于干燥过程的稳定性。然而，在这个复杂的过程中会产生应力源，如冷冻和干燥应力。冰对颗粒产生的机械应力和 PEG 层的结晶会导致颗粒融合，这些都是在冷冻过程中可能发生的情况。冷冻保护剂或冻干保护剂等辅料是在冻干前添加到颗粒悬浮液中的稳定剂，最常用的是糖类(如海藻糖)或糖醇(如甘露醇)。

关于使用冷冻保护剂或冻干保护剂来稳定纳米颗粒的几个理论中，非晶玻璃理论最为广泛接受，具体是指在冷冻过程中，冷冻保护剂凝固成颗粒周围的无定形玻璃，保护它们免受融合。2007 年，Jones 等人报道，在冷冻干燥之前，在自扩增 RNA 中加入海藻糖，可以在冷藏条件下保持至少 10 个月的稳定性，并且在转染后，观察到了高水平表达[1]。几年后，mRNA 疫苗对传染病(流感)的有效性首次在动物模型中得到证实。冻干的 mRNA 流感疫苗在小鼠免疫前 37°C 可以稳定保存 3 周[2]。该研究小组在后来的一篇论文中报道，在 70°C 条件下暴露于抗狂犬病感染的非复制 mRNA 疫苗并不影响其保护能力[3]。

CureVac 也报道，另一种同样抗狂犬病的 mRNA 疫苗经海藻糖冻干，在 5-25°C 下可以稳定保存3年，在 40°C 可稳定保存 6 个月[4]。最近，发表了一项关于 mRNA 负载 LNPs 的研究，Zhao 等人比较了两种不同的长期储存mRNA纳米颗粒的方法。他们观察到，尽管使用 20% (w/v)的蔗糖或海藻糖稳定了纳米颗粒的大小和 mRNA 的体外递送效率，但相同的颗粒在体内递送效率不高。原因可能是在冻干和重构过程中纳米颗粒结构发生了变化。在添加 5% (w/v)蔗糖或海藻糖的液氮中冷冻装载 mRNA 的 LNPs 可能是长期储存的替代方案[5]。

利用喷雾干燥技术制备 RNA 疫苗

喷雾干燥提供了一种替代方法来生产干燥疫苗，这种疫苗能耗更低，操作成本更低，并且避免了细胞冷冻和高真空。喷雾干燥是一个连续的干燥过程，它包括四个主要阶段：

一个重要的观点是，喷雾干燥疫苗可用于非传统给药途径，如口服、肺部或鼻内途径。尽管有这些优点，但在喷雾干燥过程中，由于高温和剪切力，系统可能不稳定。热应力和剪应力都增加了动能，加剧了颗粒的碰撞。在此过程中脂质部分熔化也会导致颗粒聚集，因此建议使用熔点高于 70℃ 的脂质。粒径分布、聚合物分散性指数(Pdi)接近1和高变异系数的差异是颗粒聚集的信号。可以通过添加合适的稳定剂或使用酒精来代替水溶液分散介质可以降低热应力。另一方面，可以通过使用低脂质含量或添加稳定剂来最小化剪切应力。糖类是最常用的稳定剂，但也常添加其他辅料，如二价离子、蛋白质、表面活性剂和聚合物。

1998 年，医药领域首次对脂质纳米颗粒进行喷雾干燥研究，其作者展示了将固体 LNP 悬浮液成功转化为粉末形式，使用非常低的脂质浓度(1%)和高海藻糖浓度(25%)作为喷雾干燥基质[6]。在喷雾干燥之前，在脂质纳米颗粒上添加生物聚合物，如酪蛋白、果胶或木瓜蛋白酶，可以有效防止 LNP 聚集。Gaspar 等人用木瓜蛋白酶层覆盖固体 LNP，然后用海藻糖或甘露醇喷雾干燥[7]。也有报道将装载姜黄素的固体 LNP 用一层果胶进行喷雾干燥，然后进行化学交联。交联确实可以改善固体 LNP 的物理化学性质[8]。作者也使用了不同的天然多糖，如果胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、阿拉伯胶和海藻酸盐作为壁材，但都发生了颗粒聚集。而用果胶或卡拉胶喷雾干燥含有 20-30% 油酸的 LNP 可获得稳定的粉末颗粒[9]。文献中报道了聚合物杂交 LNP，例如用透明质酸与聚丙烯酸交联制备了阿昔洛韦载药聚合物混合脂质纳米颗粒。与常规制剂相比，阿昔洛韦的溶解度可提高 30%，提高了其作为口服给药系统的生物利用度[10]。最近，Dormenval 等人用甘露醇作为稳定赋形剂制备了喷雾干燥负载 siRNA 的聚合物杂化 LNP。该小组还打算使用微流体技术进一步扩大工艺规模[11]。

目前为止，还没有商业化的喷雾干燥疫苗。然而，已有药企开展了一些研究，特别是以流感和结核病为重点的研究。关于喷雾干燥的 mRNA 治疗目前报道研究较少，与喷雾干燥的 mRNA 载药 LNPs 也较少。Patel等人首次报道可吸入的 mRNA 递送，在他们的研究中， mRNA 通过雾化方式由超支化聚氨基酯(hPBAEs)传递给小鼠，在小鼠肺上皮中观察到高水平的基因表达[12]。最近香港大学的研究人员首次表明，可以使用喷雾干燥和喷雾冷冻干燥制备可吸入的 mRNA 干粉。这种聚乙二醇化的 KL4/mRNA 复合物在健康小鼠的肺中产生了良好的基因表达，并且没有引起明显的毒性和炎症反应[13]。

结论

基于临床前和临床研究，使用 LNPs 作为纳米载体的 mRNA 疫苗已显示出治疗多种化学疾病包括传染病和癌症的巨大潜力。LNPs 与其他载体相比具有多种优势：mRNA 保护、更高载荷的递送、靶配体的结合以及与佐剂的共传递。通常情况下，mRNA 疫苗制剂以液态开发并冷冻储存。为了优化其分布和储存能力，人们对开发耐热的 mRNA 配方产生了兴趣。喷雾干燥是传统冻干技术的一个不错替代选择，因为喷雾干燥在颗粒工程和非传统疫苗给药途径有天然优势。

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