超级干货~FFPE试剂国内外横评
摘要
本次横评使用AllSheng?和国内外市场主流FFPE组织样本DNA提取试剂盒,进行提取效果的详细对比,主要指标核酸提取效率和片段大小及分布情况,前者通过Fluo-200荧光计定量,后者通过生物分析仪检测。
结果显示,奥盛试剂盒在DNA提取率以及产物片段分布与其他品牌试剂盒表现一致,在一些样品上的表现甚至更优于同类产品。
此外,我们对比了AllSheng?FFPE组织样本DNA提取试剂盒手动法提取与在Leap-Pure S24上全自动提取上进行自动化提取的差异。
结果显示上述两种方法得到的核酸产量及片段完整性均无显著差异。
试剂简介
FFPE(formalin fixation and paraffin embedding)样本,即福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本,被视为病理科的“瑰宝”,因为它们保存了大量疾病相关信息,为医学研究提供了宝贵的数据来源,是目前长期保存病理样本的主要方法,过去的几十年中,按照该方法,全世界已经存档了大量生物样品。
然而,由于技术的限制,FFPE样本在过去的几十年中并未得到充分的利用。随着科技的进步和研究的发展,现在对FFPE样本的应用已经越来越广泛。从最初的免疫组化用于疾病诊断和病理分型,到现在已经应用到各种组学研究中,FFPE样本的价值得到了更全面的发掘。
每一个FFPE样本都是珍贵且独一无二的。在样本量有限的情况下,我们应当在尽可能减少损耗的同时释放其所蕴含的生物信息。现阶段在FFPE样本中提取核酸仍存在一定的挑战性。如石蜡样本在制作过程中导致的核酸降解,难以兼容下游qPCR、测序等应用,以及提取操作过程繁琐用时较长,试剂中二甲苯会危害实验员健康,其次二甲苯会影响组织切片质量,若使用不当,容易使组织产生收缩、硬化变脆等变化。
因此我们需要在有限的样本中尽可能提取出高质量的核酸,同时实现提取操作自动化,在这里我们展示的是奥盛试剂盒从大鼠石蜡包埋组织样本和人体组织样本中提取基因组DNA的方法,与市面上同类型试剂盒提取效果进行对比,结果显示,DNA提取浓度、完整性等方面与国内外同类型产品表现一致。
材料与方法
试剂提取效率对比
配制三个不同批次的试剂,根据FFPE切片/卷片组织面积的大小,刮取5-10张表面积为25-30mm2的卷片,分别进行手工法提取,等体积(50 μL)洗脱所有样本提取流程如图1所示,将所得纯化的DNA通过Fluo-200荧光计dsDNA高灵敏定量分析试剂盒精准定量提取浓度(dsDNA),并通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA完整性,使用GAPDH基因(扩增片段长度分别为322bp和99bp)对DNA产物进行qPCR分析,所有样本的起始体积/量一致。
图1 试剂整体操作流程。上图为奥盛试剂盒操作流程。其中手工法提取需要根据步骤按顺序添加试剂。而配合仪器进行自动法提取,只需要直接将样品加入到指定孔中即可,其余试剂均以提前加入其他孔位,操作相对来说更加便利
各品牌试剂抽提效果对比
奥盛试剂盒和其他国内外三种对标试剂盒分别提取不同人组织FFPE样本,等体积(50 μL)洗脱所有样本,将所得纯化的DNA通过Fluo-200荧光计和dsDNA高灵敏定量分析试剂盒精准定量提取浓度(dsDNA),琼脂糖凝胶电泳验证DNA完整性,以及通过Allsheng? NGS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒进行不同品牌提取产物的建库产量及峰型图分析对比。与同类产品提取人体石蜡包埋组织样本比较。
自动化提取效果验证
为确定全自动和手动抽提方法是否可以获得相同的核酸产量和质量,我们使用奥盛试剂盒进行手动抽提以及在Leap-Pure S24上全自动提取连续的FFPE样本。每个样本上样量一致,洗脱体积均为50μL,进行对比测试。
结果与分析
试剂抽提效率验证
对三批提取产物浓度测定分析发现,AllSheng?与A品牌试剂盒对不同FFPE组织样本的提取效率接近或超出对标试剂(图2-1),片段分布和片段完整性(用不同大小引物对产物进行扩增后,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,均显示出完整的4条片段)与对标产品一致(图2-2、图2-3),对DNA产物进行GAPDH基因(扩增片段长度分别为322bp和99bp)qPCR分析,发现不同长度扩增片段浓度均无明显差异(图2-4)。
图2-1 AllSheng? FFPE组织样本DNA提取试剂盒与对标试剂盒提取产物浓度
图2-2 AllSheng? FFPE组织样本DNA提取试剂盒与对标试剂盒提取产物琼脂糖电泳结果
图2-3 AllSheng? FFPE组织样本DNA提取试剂盒与对标试剂盒提取产物的片段完整性分析结果
图2-4对提取产物进行不同片段的qPCR结果
各品牌试剂抽提效果验证
通过对不同人组织FFPE样本提取发现,四种试剂盒对不同样本的提取情况一致,奥盛试剂盒和其他国内外三种对标试剂盒对不同的样本提取效率有差异。在C样本提取中,奥盛试剂盒提取效率显著高于三种对标试剂盒(图3-1),三个样本的片段分布和片段完整性与对标产品一致(图3-2),将四种试剂盒提取产物投入相同量进行建库,奥盛试剂盒建库后的文库产量与另外三种试剂盒的文库产量无明显差异。
图3-1四种试剂盒提取不同人组织FFPE样本的浓度
图3-2 四种试剂盒提取不同人组织FFPE样本提取产物琼脂糖凝胶电泳图及完整性分析图
实验组 | Qubit 浓度 | 文库产量 |
T品牌 | 17.8ng/μl | 445ng |
Q品牌 | 13ng/μl | 325ng |
A品牌 | 17.1ng/μl | 427.5ng |
奥盛 | 17.5ng/μl | 437.5ng |
图3-3 四种试剂盒提取产物建库实验结果
自动化提取效果验证
在Leap-Pure S24上全自动提取连续的FFPE样本与手工法提取对比。结果显示Leap-Pure S24提取产物浓度均可达到手工的90%以上(图4-2),琼脂糖凝胶电泳效果表明两种方式的提取产物片段分布一致(图4-3),用于下游应用(如使用Agilent Bioanalyzer系统进行DNA分析,以及qPCR和RT-PCR分析)的核酸质量基本一致(图4-4、4-5)。且在操作方式上Leap-Pure S24全自动核酸提取仪均需将样本放入试剂条中即可,手工操作时间较手工提取缩短90%以上。
点击图片查看详情
图4-1 全自动核酸提取与手工法提取效率对比
图4-2 手工与S24提取产物的琼脂糖凝胶电泳结果
图4-3 手工法与S24提取产物在安捷伦4150上片段分析结果
图4-4 S24与手工的提取产物对不同大小扩增子的qPCR结果
总结
FFPE组织样本是目前国内外运用最为广泛的组织保存形式。目前,分子靶向治疗逐步成为肿瘤治疗的主流。在临床用药前对患者基因突变状态进行检测,可正确指导临床个体化用药。减轻患者经济负担.提高分子靶向药物治疗效果。因此,从FFPE样本中提取高质量的DNA进行分子靶标检测也逐渐受到关注。从FFPE组织样本中提取到能够有效扩增的DNA不仅适用于回顾性研究,也对疾病的诊断与鉴别、评估疾病预后和探索疾病分子机制具有重要意义。
AllSheng? FFPE组织样本DNA提取试剂盒采用高效组织裂解缓冲液和无毒除蜡剂进行一步法脱蜡裂解,利用硅羟基磁珠与核酸分离纯化方法的原理,从石蜡包埋组织切片、石蜡块或福尔马林等固定液组织中快速高效的提取样品中的DNA,在浓度、片段分布与质量(下游实验)方面与对标试剂一致。试剂不含二甲苯等有害物质,并且操作简单,无需多次离心。该试剂盒适用于多种FFPE组织类型,可以进行手工抽提,也可以配套仪器进行全自动化操作。搭配我司Leap-Pure S24全自动核酸提取仪,可实现提取过程全自动化,极大减少了人工操作步骤。
关于奥盛
奥盛定位生命科学工具提供商,专注生命科学检测设备及自动化解决方案。公司围绕生物样品核酸蛋白纯化、自动化工作站,生物吸收光、荧光及发光检测三大技术平台,在生命科学领域进行了深度布局。
目前,公司拥有省级高新技术企业研究院,是2022年第一批浙江省”专精特新”中小企业。
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