本文要点：通常，长波长吸收近红外II（NIR-II）染料在聚集态下荧光效率较低，对于聚集体引起的淬灭效应，同时提高效率和延长吸收是NIR-II染料的一个挑战。在这里，三种苯并[1，2-c：4，5-c']双[1，2，5]噻二唑（BBT）衍生物（TPA-BBT，FT-BBT和BTBT-BBT）用于阐明荧光淬灭机制。当BBT衍生物掺杂到小分子基质中时，它们表现出完全不同的荧光行为。结构扭曲的TPA-BBT表现出短程交换相互作用引起的荧光淬灭，而具有共面共轭骨架的FT-BBT和BTBT-BBT表现出浓度依赖性淬灭过程，即从长程偶极-偶极相互作用转变为交换相互作用，这主要归因于吸收和发射之间的大量光谱重叠。通过精确调节掺杂浓度，FT-BBT和BTBT-BBT纳米颗粒（NPs）在约2.5wt%掺杂浓度下呈现最佳的NIR-II荧光亮度。掺杂的NPs具有良好的生物相容性，可作为980 nm激光激发下高分辨率血管成像的荧光造影剂。这些范例证明，分子掺杂可以通过抑制长距离能量迁移来提高长波长吸收NIR-II荧光团的荧光效率。

背景：与短波可见光和近红外I区（<900 nm）相比，近红外II区（NIR-II，1000–1700 nm）的荧光生物成像具有深穿透深度、高信背景比和对低组织自发荧光和弱光物质相互作用的出色分辨率。然而，除了一些聚甲基染料和半导体聚合物外，大多数有机NIR-II染料的最大吸收位于650-900nm范围内，短激发波长会严重限制成像分辨率和深度。虽然具有供体-受体-供体（D-A-D）结构的有机荧光团可以轻松调节光物理性质，但长波长吸收的NIR-II荧光团在聚集态下表现出严重的聚集引起的淬灭（ACQ）效应。为了提高NIR-II荧光效率，分子结构修饰已经投入了许多努力。本文合成了三种具有扭曲或共面共轭主链的BBT衍生物，以阐明聚集态下的荧光淬灭机制（方案1）。结果表明，荧光淬灭主要源于具有共面结构的FT-BBT和BTBT-BBT的长程偶极-偶极相互作用，具有扭曲结构的TPA-BBT的短程交换相互作用。因此，将BTBT-BBT掺杂到低含量的基质中可以阻断长程能量迁移，而BTBT-BBT掺杂的NPs在980 nm激光激发下具有较高的荧光亮度，可进一步用作NIR-II荧光造影剂来可视化血管系统。

方案1

研究内容：为了扩展有机染料的吸收曲线，共面构型的供体-受体型分子结构是一种有效的设计原则;同时，应将大块基团固定在分子骨架上，以减少意外的分子间π-π堆积。基于这一理念，设计并合成了BBT衍生物（BTBT-BBT）（图1）。

图1

此外，还合成了组合DBT作为分子基质，晶体数据表明DBT具有完全共面和刚性结构，丁苯基部分位于共轭面的两侧，因此可以合理推断BTBT-BBT也具有共面结构，并且块侧链可以阻碍π-π堆积（图2D）。密度函数理论的理论计算表明TPA-BBT具有高度扭曲的结构，扭转角为∼26°和50°，而分子结构在FT-BBT和BTBT-BBT中逐渐平坦化，BTBT-BBT采用全共面结构，扭转角为0°（图2A–C）。过循环伏安法评估前沿分子轨道（图2E，F），FT-BBT的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）分别为-5.16和-3.84 eV，BTBT-BBT的带隙分别为-5.05和-3.85 eV，因此FT-BBT和BTBT-BBT的带隙分别为1.32和1.20 eV。

图2

进一步研究了吸收和荧光的溶剂效应。如图3所示，由于分子内电荷转移效应，BBT衍生物在近红外区域出现吸收带。随着溶剂极性的增加，TPA-BBT对甲苯和二氯甲烷的最大吸收峰分别为730和712 nm、FT-BBT为846和836 nm、BTBT-BBT为947和932 nm。在甲苯溶液中，TPA-BBT、FT-BBT 和 BTBT-BBT 的摩尔消光系数为 2.0 × 104， 3.8 × 104和 4.5 × 104 L摩尔−1厘米−1，分别表明分子构象平面化可以明显增强染料的吸收能力。与TPA-BBT相比，由于共面分子结构促进了共轭骨架上的电子离域，FT-BBT和BTBT-BBT的最大吸收峰有110和220 nm红移。由于BBT基团较强的电子接受能力，TPA-BBT、FT-BBT、BTBT-BBT表现出溶剂极性依赖性的NIR-II荧光发射，FT-BBT在甲苯和二氯甲烷的最大发射峰分别为998和1045 nm，而BTBT-BBT的则分别为1092和1178 nm。TPA-BBT在甲苯中具有以992 nm为中心的强荧光峰，在二氯甲烷中在1022 nm处具有较弱的荧光峰，表明TPA-BBT的荧光特性因其较强的分子内电荷转移效应而对溶剂极性更敏感。尝试使用DBT作为基质，并使用TPA-BBT，FT-BBT或BTBT-BBT作为掺杂剂来制造掺杂的NP。如图3B，E，H所示，TPA-BBT，FT-BBT和BTBT-BBT的吸光度与掺杂含量呈线性关系，而TPA-BBT，FT-BBT和BTBT-BBT NPs的最大吸收峰分别保持在730，840和957 nm不变，表明不同掺杂含量体系中基态的分子构象相同。如图3C，F，I所示，随着掺杂浓度从100wt%下降到1wt%，FT-BBT的最大发射峰从1081逐渐蓝移到975 nm，BTBT-BBT的最大发射峰从1120 nm逐渐蓝移到1062 nm，而TPA-BBT掺杂的NPs在937、1011和1100 nm处表现出不变且分辨率良好的发射带，分别对应于0-0、0-1和0-2振动跃迁， 0-0和0-1发射带的强度比随着掺杂含量的降低而逐渐增大，这些BBT衍生物NPs的光谱变化可归因于低掺杂含量下的弱自吸收效应，而在长波长区域未观察到低能量准分子/激发复合体发射。

图3

为了进一步揭示荧光行为差异的根源，除掺杂浓度外，在相同条件下进行了NIR-II荧光成像。如图4A–C所示，当掺杂含量从100wt%下降到25wt%时，NPs的荧光强度缓慢增加或减少，而趋势在25wt%以下变化很大，表明25wt%是临界掺杂含量。如图4G所示，由于DBT基质和NIR-II染料具有相似且较大的芳香族结构，染料应均匀分散到基质中，临界分子间距离（Dc） 由以下公式计算得出:

 其中V是DBT的晶胞体积（∼5794.96 Å3）、Xc是临界掺杂摩尔含量（XcTPA-BBT、FT-BBT和BTBT-BBT分别为=0.202、0.208和0.137），N是晶胞中DBT的数量（N=4），2V/N用于评估染料的体积。根据以上数据，DcTPA-BBT、FT-BBT和BTBT-BBT的计算值分别为25.5、25.2和28.4 Å。实际分子间距离可能大于Dc因为DBT是无定形的，松散地堆积在NPs中。由于Dc与共轭骨架的分子长度相当（图2A），表明ACQ可归因于交换相互作用（德克斯特能量转移）。由于FT-BBT或BTBT-BBT掺杂NPs具有与稀土离子掺杂系统相似的浓度淬灭现象，NIR-II染料之间的相互作用类型可以通过以下公式估计：其中I为荧光强度，x为摩尔掺杂含量，k和β为相同激发条件下的常数，θ为相互作用类型，θ=3、6、8、10分别表示与最近邻分子的交换相互作用、偶极-偶极相互作用、偶极-四极相互作用和四极-四极相互作用。如图4D–F所示，I/x和x的关系以对数图绘制，−θ/3 是线性拟合的斜率，因此 TPA-BBT、FT-BBT 和BTBT-BBT 的θ值分别为 2.6、5.1 和 4.1。TPA-BBT的θ值接近3，表明浓度淬灭源于短程交换相互作用。而FT-BBT和BTBT-BBT的θ值大于3且接近6，表明浓度淬灭主要是由偶极-偶极相互作用引起的，即类似Föster的能量迁移。如图2所示，TPA-BBT具有较大的斯托克斯位移（∼290 nm），吸收和发射光谱之间几乎没有重叠，NPs中的激子能量迁移仅通过短程交换相互作用发生（图4H）。不太可能的是，由于结构平面化和刚性，FT-BBT和BTBT-BBT都具有较小的斯托克斯位移（FT-BBT为135 nm，BTBT-BBT为102 nm），聚集态的吸收和发射之间存在较大的光谱重叠，激子能量迁移主要来源于长程偶极-偶极相互作用，导致聚集态的ACQ严重（图4I）。因此，将长波长吸收的NIR-II染料掺杂到基质中是克服长程淬灭效应和提高荧光效率的有效方法。

图4

由于掺杂浓度为2.5wt%的BTBT-BBT NPs在980 nm激光激发下的最大吸收峰为957 nm，荧光亮度最高，因此用于进行进一步的实验。首先，利用动态光散射和透射电子显微镜（TEM）研究了NPs的尺寸分布和形貌，BTBT-BBT掺杂NPs表现出不规则的聚集NPs，流体动力学尺寸和zeta电位分别为72.2 ±19.1 nm和−32.61 mV（图5A）。通过2-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-3，5-二苯基-2H-四唑-3-溴化铵（MTT）测定法评估NPs的生物相容性，当孵育浓度高达100μg/ mL时，三阴性乳腺癌细胞的活力仍约为90%（图5B）。此外，活/死共染色测定还表明细胞保持高存活率（图5C）。上述实验数据表明，2.5wt%掺杂的BTBT-BBT NPs具有良好的生物相容性，应该可以安全地用作体内成像造影剂。如图5D所示，在尾部静脉给药后15分钟后观察到不同的血管解剖结构，小鼠后肢主要血管的表观宽度为∼0.42mm，信噪比为∼1.8（图5E）。此外，BTBT-BBT掺杂NPs的药代动力学过程可以通过血管成像直接可视化。后肢主要血管的荧光强度在注射后1小时内迅速降低，然后逐渐消失（图5D）。体内成像实验表明，BTBT-BBT掺杂的NPs可以作为一种优秀的NIR-II荧光探针用于血管系统可视化。

图5

综上所述，新型NIR-II荧光团BTBT-BBT具有以∼947 nm为中心的强吸收峰，具有完全共面构象的吸收峰，在溶液中的QY为7.4%，而聚集体表现出严重的荧光淬灭。为了阐明其淬灭机理，详细研究了3种BBT衍生物的光物理性质。实验结果表明，荧光淬灭主要源于具有共面构象的FT-BBT和BTBT-BBT的长程偶极-偶极相互作用，而具有扭曲结构的TPA-BBT的短程交换相互作用。这些现象的原因可能在于吸收和荧光之间的光谱重叠程度，而较大的光谱重叠将通过非辐射途径促进类似Föster的能量迁移和能量耗散。结果表明，将BTBT-BBT掺杂到低含量（∼2.5wt%）的分子基质中可有效阻断长程能量迁移途径，且BTBT-BBT掺杂的NPs在980 nm激光激发下具有较高的荧光亮度，可进一步作为NIR-II荧光造影剂研究血管系统。

参考文献

DOI: 10.1002/agt2.290

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