RP-LC-MS/MS法定量mRNA中游离/非结合核苷
这种方法可以检测和定量合成类mRNA中大多数修饰的核苷。这不仅包括在体外转录过程中有意通过三磷酸盐引入的修饰，还包括商业化NTP原料变化引入的杂质，核苷被氧化产生的杂质等。该方法还能检测从帽结构释放的m7G或核糖甲基化修饰。使用LC-MS/MS，可以在核苷水平上分析mRNA，从而在单次运行中检测和量化数十种不同的修饰核苷。该方法可以很容易地对体外转录的NTP进行质量控制。
溶液A：5mM醋酸铵缓冲液。乙酸调pH到5.3
溶液B：乙腈。必须使用LC-MS级
梯度条件：见下表
样
品
制
备
用0.6U的核酸酶P1、0.2U的蛇毒磷酸二酯酶、0.2U的牛肠磷酸酶和10U的Benzonase核酸酶，在5mM Tris （pH8）和1mM氯化镁溶液中，37℃酶解2小时，将10μg的RNA酶切至核苷水平。另外，可以选择性地添加脱氨酶抑制剂，如喷司他汀（腺苷脱氨酶抑制剂，200ng）和四氢尿苷（胞苷脱氨酶抑制剂，500ng），以避免核苷降解。
标样：腺苷或另一种主要核苷（C, U或G）
色
谱
系
统
色谱柱：Synergi Fusion, 4μm, 80孔径, 250×2.0mm; Phenomenex
柱温：35℃
流速：0.35mL/min
检测器：UV 254nm
仪
器
参
数
质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）的三重四极杆（QQQ）
模式：正离子模式，dMRM（动态多反应监测）
ESI参数：气体温度300℃，气体流量7L/min，雾化器压力60psi，鞘气温度400°C，鞘气流量12L/min，毛细管电压3000v，喷嘴电压0v
QQQ参数：取决于必须检测的修饰核苷。建议对每台质谱仪的仪器参数（破碎器、碰撞能量、加速器电压）进行优化，以达到最佳灵敏度
分析——相对定量
用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。
修饰核苷的量用腺苷校正，以消除进样量不同带来的差异。为此，从254nm处记录的紫外色谱中获取腺苷的峰面积。
通过在每个样品中加入同位素标记的标准物进行定量。
A(MS mod)=修饰核苷酸的MS峰面积
n(ISTD)=每个样品的内标量
A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积
A(UV腺苷)=腺苷的峰面积
或者，可以选择另一种主核苷（C、U或G）进行校正。例如，在酶促多聚腺苷酸化的情况下，它会导致未知或不同数量的腺苷。
分析——绝对定量
用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。
修饰核苷的量用腺苷校正，以消除进样量不同带来的差异。为此，从254nm处记录的紫外色谱中提取腺苷的峰面积。
使用外部校准溶液进行绝对定量。准备浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100和500nM的校准溶液，用于MS/MS检测修正，每个修饰含有等量的内标。
每种稀释液注入10μL，在1-5000fmol范围内进行校准。对于腺苷，准备浓度为0.1、1、10和100fmol的校准溶液。每种稀释液注入5μL，在0.5-500pmol范围内进行校准。响应因子对应于校准曲线线性拟合的斜率（峰面积对应于各自的量）。
X(每个修主核苷的修饰量)=绝对定量，每个主核苷修饰量
A(MS mod)=各自修饰的MS峰面积
A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积
n(ISTD)=每个样品的内标量
rf(MS mod/MS ISTD)=各自修饰物与内标物之比的响应因子
A(UV腺苷)=腺苷的紫外峰面积
RF(UV腺苷)=相应修饰的响应因子
对于已定义的已知序列的mRNA：
修饰核苷的数量可以归一化为RNA分子的数量。
X(mod/RNA)=绝对定量，每个RNA分子的修饰量
N(腺苷)=RNA序列中各自修饰的数目
或者，可以选择另一种主核苷（C、U或G）进行归一化。防止在酶促聚腺苷酸化的情况下，导致未知数量的腺苷。
参考文献：
USP：Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality （Draft guidelines: 2nd Edition）
全部评论(0条)
推荐阅读
-
- RP-LC-MS/MS法定量mRNA中游离/非结合核苷
- RP-LC-MS/MS法定量mRNA中游离/非结合核苷
-
- 【会议预告】当类器官遇上高内涵：3D 模型与细胞成像相结合的技术基础与应用前景—石家庄站
- 【会议预告】当类器官遇上高内涵：3D 模型与细胞成像相结合的技术基础与应用前景—石家庄站
-
- 前沿应用|低场核磁共振技术用于固体药物多晶型的定性与定量研究(二)
- 在上一期的内容中，我们介绍了固体药物多晶型的现象和研究现状，对生物利用度的影响以及低场核磁（时域核磁）共振技术对原料药晶型的定性和定量研究。这次我们选择其中一种晶型详细讨论——通道型水合物。
-
- 热点应用丨赛里安GCMS结合EST FLEX2固相微萃取模块测定4种异味物质
- 热点应用丨赛里安GCMS结合EST FLEX2固相微萃取模块测定4种异味物质
-
- 仅使用低温等离子体和H-DRC的结合在半导体工艺中主要管控元素的超痕量分析
- 仅使用低温等离子体和H?-DRC的结合在半导体工艺中主要管控元素的超痕量分析
-
- 12月13日直播有礼 | 液相系列收官课程来袭，教您全面掌握高效定性定量分析及方法学验证
- 液相实操提升系列收官课程——定性定量分析/方法学验证来咯！别犹豫，快上末班车，直接学！
-
- 【点播课程】如何利用荧光寿命多标技术结合光谱分辨检测技术对更多亚细胞目标进行成像
- 【点播课程】如何利用荧光寿命多标技术结合光谱分辨检测技术对更多亚细胞目标进行成像
-
- 液质定量客户福利：免费获得Quanpedia方法库及使用方法培训(内含讲座)
- 液质定量客户福利：免费获得Quanpedia方法库及使用方法培训(内含讲座)
-
- LAMBDA 365+紫外可见光谱仪：蛋白质的快速定量神器
- LAMBDA 365+紫外可见光谱仪：蛋白质的快速定量神器
-
- LAMBDA 365+紫外可见光谱仪：蛋白质的快速定量神器
- LAMBDA 365+紫外可见光谱仪：蛋白质的快速定量神器
①本文由医疗器械网入驻的作者或注册的会员撰写并发布，观点仅代表作者本人，不代表医疗器械网立场。若内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们立即通知作者，并马上删除。
②凡本网注明"来源：医疗器械网"的所有作品，版权均属于医疗器械网，转载时须经本网同意，并请注明医疗器械网(www.120med.com)。
③本网转载并注明来源的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品来源，并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱：hezou_yiqi
最新话题
最新资讯
- 一次性使用真空采血管(EDTA抗凝管：血常规管)生产厂家哪家好？
- 一次性使用真空采血管生产厂家哪家好？如何选择？
- 观众预登记开通|第32届成都医博会观众预登记全面启动，邀您3月7-9日共聚蓉城！
- 焕新起航，蓄势前行|第32届成都医博会火热来袭！
- 一次性使用唾液采集器：便捷高效的唾液样本收集保存运输解决方案！
- 【邀请函】第32届成都医博会来啦，2025年3月7-9日，与您相约成都世纪城国际展览中心！
- TOC清洁验证棉签擦拭棒在生物制药等行业中的重要应用！
- 一次性无菌宫颈采样拭子助力女性HPV检测便捷、安全高效采样取样！
- 一次性使用碘伏溶液皮肤消毒器：得力的术前大面积皮肤消毒工具！
- 【双节同庆】坛墨质检第六届标物节，佳节共庆， “粽”享壕礼！
作者榜
成都世纪康博会展有限公司
参与评论
登录后参与评论