【点播课程】如何利用荧光寿命多标技术结合光谱分辨检测技术对更多亚细胞目标进行成像
对具有不同激发光谱和发射光谱的荧光团进行光谱分辨检测，是进行多重荧光显微镜检查的常规方法。然而，由于许多常用荧光团的光谱存在重叠，这种技术仅限于三到四个目标。相比之下，荧光寿命多标技术利用荧光寿命的差异来分离具有相似光谱特性的荧光团。将这两种技术结合起来，可以扩大多标程度，以适应更多的目标。然而，虽然荧光团的光谱特性已为常规表征，但荧光寿命信息却鲜有报道，这阻碍了荧光寿命多标技术的使用及其与光谱分辨检测技术的结合。
为了找到具有合适荧光寿命特性的荧光团，我们将注意力转向了基于合成荧光团的细胞渗透探针，这些探针可用于各种目标并具有不同颜色。这些探针不需要基因工程，而且可以在标记步骤中结合多种探针。这使得它们成为光谱解析荧光寿命多标的理想选择。
我们通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）鉴定了18种细胞渗透性合成探针，发现其中有8对组合适合荧光寿命多标。当在不同光谱通道中组合多对探针时，我们可以直接对多达四个亚细胞目标进行光谱解析荧光寿命多标。然而，合成探针只能用于少数目标，而且有时会显示出不合适的寿命特性。
因此，我们在使用合成有机探针的基础上，对合成荧光团采用了第二种标记策略，即自标记蛋白标签。可基因编码的自标记蛋白标签可与感兴趣的蛋白质融合，因此几乎可以标记任何需要的亚细胞靶标。我们设计了自标记蛋白标签 HaloTag7 的变体（即 HaloTag9、HaloTag10 和 HaloTag11），使结合的荧光团显示出不同的荧光寿命。
结合自标记蛋白标签和合成探针，我们可以在四个光谱通道中对多达八个目标进行成像。我们希望这两种方法能促进荧光寿命多标技术在活细胞中的应用。
如何结合光谱解析检测和荧光寿命多标技术，对更多亚细胞靶标成像。
可对多达四个亚细胞目标成像的合成探针组合。
自标记蛋白标签和合成探针组合，可在四个光谱通道中对多达八个目标成像。
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