天美讲堂丨什么是FLIM-荧光寿命成像-医疗器械网

天美讲堂丨什么是FLIM-荧光寿命成像

来源：天美仪拓实验室设备（上海）有限公司分类：动态 2023-10-16 16:31:59 66阅读次数

文章要点

1.荧光寿命成像（FLIM）技术用于测量整个样品荧光寿命的变化。

2.使用脉冲激光器和时间相关单光子计数（TCSPC）来记录FLIM图像。

3.荧光寿命成像（FLIM）提供了传统荧光强度成像无法获得的额外信息。

为什么使用FLIM?

PART

荧光寿命成像（FLIM）是一种成像技术，样品荧光寿命的变化在图像中产生对比度（图1）。FLIM广泛用于生物医学成像，其中组织和细胞用一种或多种荧光染料染色。染料的荧光寿命取决于局部微环境，FLIM比其他成像技术（如宽场成像）提供了额外的维度，如环境信息。FLIM也越来越多地用于研究光致发光材料，例如对纳米材料、太阳能电池和半导体的载流子寿命变化进行成像。

图1 使用RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪测量（a）小鼠肠道切片和（b）小鼠肾脏切片的FLIM图像。

FLIM共聚焦显微镜

PART

FLIM成像是使用共聚焦显微镜获取的（图2）。显微镜配备有脉冲激光器，激光由物镜聚焦到样品上形成一个小斑点。使用滤光片或单色仪（图2的排列方式）选择来自样品的荧光，并使用单光子计数检测器如光电倍增管（PMT）进行检测。

图2 FLIM共聚焦显微镜

FLIM采集

PART

荧光衰减是使用时间相关单光子计数（TCSPC）获得的。在TCSPC中，用脉冲激光激发样品，并测量激光脉冲和检测到的荧光光子之间的时间（图3a）。该过程重复数百万次，以创建荧光光子计数与到达时间的直方图（图3b）。

将样品上感兴趣的区域划分为像素，并使用TCSPC记录每个像素的荧光衰减（图3c）。通过移动样品台（样品台扫描）或激光点（激光扫描）将激光点引导到每个像素上。这个过程按顺序发生，依次记录每个像素的荧光衰减，以构建直方图数据合集。

图3 （a）使用TCSPC记录单个光子到达时间；（b）单个像素的荧光衰减直方图；（c）感兴趣区域内逐个记录像素的荧光衰减直方图。

FLIM分析

PART

计算每个像素荧光衰减直方图的荧光寿命。通常用最小二乘法将单指数模型拟合到每个衰减来计算，以获得荧光寿命τ（图4）。将通过拟合获得的荧光寿命对应到颜色图上，构建颜色编码的荧光寿命图像。

图4 计算FLIM数据，每个像素的荧光寿命对应颜色变化，构建颜色编码的荧光寿命图像。

结论

荧光寿命成像（FLIM）是光致发光光谱的补充，提供了关于样品微环境的信息。使用时间相关单光子计数（TCSPC）获取寿命信息，用单指数模型来拟合荧光衰减曲线，构建颜色编码的荧光寿命图像。通过RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪不仅可以获取拉曼光谱信息，还可以实现荧光寿命成像（FLIM），实现全方位多维度样品信息检测，满足科研多“维度”需求。