关于类器官，其鲜明的特点很多：

血管化难，在所有的类器官研究中，尤其以脑类器官为例，其发展并不太顺利，最主要的原因在于脑类器官系统缺乏体内脑组织的微环境、神经元回路、血管生成和免疫系统建立。尤其血管的缺乏往往会导致脑类器官中心坏死，从而进一步干扰其正常发育和神经元迁移路径。尽管许多研究尝试了将其与血管干细胞进行共培养，为上述问题提供了一定的解决方案，但营养供应和真实血液微环境的问题依然是研究人员的一大困扰。

免疫化难，近年来免疫治疗的兴起极大推动了肿瘤研究的发展，然而由于种属特异性、人源化体系的复杂性、免疫系统的部分或无效重组建等问题，致使肿瘤模型面临着巨大的挑战。尽管类器官的出现给肿瘤免疫治疗指出了新的探索方向，但现有的类器官中由于缺乏免疫细胞极大地限制了其深远发展。

系统化难，大量研究表明许多疾病的发生发展都是由多器官系统共同作用完成的，而传统的单个类器官虽然能够较为真实的模拟体内单个器官的功能及环境，但对于研究多系统发生的诸多疾病类型，依然存在一定的缺陷，因此构建多系统类器官模型仍需要科研人员进一步探索和开发。

鉴于肿瘤类器官和3D细胞球模型在形态、结构复杂性、表型和对化学疗法的药物灵敏度方面的独特优势，有着比单层生长的细胞更接近人类实体肿瘤环境，可以更好地进行药物谱分析和细胞毒性测试，因此药物的早期筛选越来越依赖于3D细胞培养。近年来肿瘤球状体已被用于优化卵巢癌和肝细胞癌等相关研究。然而， 基于3D细胞球模型进行药物筛选目前仍面临着一些挑战：例如每个样本孔中的细胞球数量以及形状和大小需保持一致，以便降低平行样本之间的差异性。为了应对这一挑战，赛默飞研发人员为大家提供了以下提示和技巧：基于高通量筛选检测生成均匀且可重现的肿瘤细胞球模型以及部分实用分析方法。

基于3D肿瘤细胞球制备和分析的基本工作流程

利用3D细胞球进行药物筛选的另一挑战是如何明确药物渗透性从而优化处理时间。细胞球模型会使实验设计和数据分析变得更为复杂，但这些问题可以通过使用正确的试剂、设备和方案得以解决。本文简明概述了可用于3D肿瘤细胞球评估药物反应的多种高通量检测方案，还提供了一些实用的实验技巧用于处理细胞球和采集数据，以获得最有意义的结果。以下描述的所有细胞球模型均以最适的Gibco?细胞培养基并在Nunclon spherea板中进行培养生成。

2D和3D培养中的球状体形态以及阿霉素处理的有效性。

（A） 处理 后72小时，对照和经阿霉素处理的PANC-1球状体的形态。使用Thermo Scientific? EVOS? M7000智能细胞成像系统在4x物镜下采集图像。比例 、尺：650 μm。（B）2D和3D培养中经阿霉素处理的PANC-1（左）和HepG2（ 右）球状体的剂量反应曲线。

细胞活性检测分析。

（A） 图像显示紫杉醇处理后SKOV-3球状体的活细胞/死细胞染色。使用CellInsight CX7 HCS高内涵平台在4x物镜和共聚焦模式下采集图像。在指定的孔中用70%甲醇处理细胞（杀死细胞），将其用作检测的阴性对照。（B）随着紫杉醇浓度增加的细胞活性百分比曲线。在GraphPad Prism 软件中，将使用HCS Studio软件获得的值绘制成曲线，并使用非线性回归进行拟合缩放。N = 2。

细胞凋亡检测分析

（A） 对照和经依托泊苷处理的MDA-MB-231球状体的代表性图像。比例尺：500 μm。（B）Caspase-3/7信号强度与依托泊苷浓度增加的关系图。每种处理浓度均重复作用于六个球状体。根据从HCS Studio软件获得的数据，使用GraphPad Prism软件生成绘图。直方图代表标准差；N = 2。（C）MDA-MB-231球状体的原始通道（左）和经过背景校正的通道图像（右）

细胞增殖检测分析

（B）代表性图像显示未经秋水仙碱和经秋水仙碱处理的T-47D球状体中的Click-iT EdU染色（红色）。使用CellInsight CX7 HCS平台在4x物镜和共聚焦模式下采集图像，比例尺：200 μm。（C）未经秋水仙碱和经秋水仙碱处理的T-47D球状体中细胞增殖的点图分析。使用HCS Studio软件中的通用强度测量工具分析Click-iT EdU信号（y轴）；N = 2。通过非配对t检验得到的与对照的差异分析，P<0.0005

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