层析纯化小课堂 | 离子交换层析温故知新篇
现在离子交换层析作为最广泛的分离纯化方法之一，应用于蛋白质、多肽、核酸以及其他带电荷的生物分子的分离。该方法还可以分离只有微小电荷差异的不同分子，例如只有一个带电荷氨基酸差别的两个蛋白。
这些特征使得离子交换层析可以很好地应用于整个层析纯化过程的样品捕获、中度纯化及精纯步骤，既适用于少量样品的纯化分析也可以用于纯化千克级别的样品。
本篇文章将继续开启层析纯化小课堂，从离子交换层析的理论和应用两方面出发，带大家温故知新，一探离子交换层析纯化方法的神奇。
图1：线性梯度洗脱模式下典型的高分辨率离子交换层析
离子交换层析对分子的分离是基于它们表面净电荷的差异。分子的电荷性质差异越大，它们所带的总电荷、电荷密度以及表面电荷分布的差异会导致他们与加载电荷后的离子交换层析填料的结合能力不同。
离子交换层析纯化一般过程
a
用平衡缓冲液平衡离子交换层析填料/柱。
b
带有相反电荷的蛋白质结合在离子交换层析填料的带电基团上，从而在柱上富集。无电荷的蛋白质，或是与填料带有相同电性的分子则会流穿。
c
使用梯度来增大离子强度，替换掉结合的分子，因为缓冲液中的离子会同蛋白质分子竞争结合位点。
d
进一步增大离子强度来替换掉带有更多电荷的蛋白质分子（结合更紧密）。
e
用最高离子强度的缓冲液进行清洗以去除任何离子型结合的蛋白分子。
f
对离子交换层析填料/柱再平衡。
常见离子交换层析填料的选择
名称 | 平均粒径 (μm) |
SOURCE 15 | 15 |
SOURCE 30 | 30 |
Sephrose High Performance | 34 |
Sepharose Fast Flow | 90 |
Sepharose 4 Fast Flow | 90 |
Sepharose XL | 90 |
Sepharose Big Beads | 200 |
Capto HiRes | 9 |
Capto ImpRes | 40 |
Capto ImpAct | 50 |
Capto | 90 |
SOURCE填料由聚苯乙烯-对乙烯基苯制成的高度分散的球形多孔颗粒，该填料有利于高流速条件下的高分辨率分离过程。
Sepharose填料是基于琼脂糖基架的，具有高流速与高分辨率不同区分的填料，可根据纯化过程对分辨率的要求程度、结合载量及流速选择最合的填料。
Capto填料比Sepharose基架填料具有更高的刚性，且反压更低，使得该填料具有更好的稳定性，更适合于具有规模放大的应用需求。
Capto HiRes系列预装柱可以有效分离表面电荷具有极小差异的生物分子，而且性能稳定，同时可以实现MonoBeads层析方案的平稳转移。目前在结构研究和蛋白质分析、制备高纯度蛋白质的过程中是首要选择。
pH>pI，选择阴离子交换基团 (Q/DEAE/ANX)
pH
该列表列出了目前离子交换层析纯化填料所支持的产品形式，以及配套手动/仪器纯化使用方法，以作参考。
离子交换层析应用指南
4招实现完美效果~
HiTrap Capto IEX Selection Kit
图2：HiTrap Capto IEX Selection Kit (Capto离子选择试剂盒套装)
HiTrap Capto IEX Selection Kit (Capto离子选择试剂盒套装)内含五支不一样的1 mL层析柱，除了常用的强阴离子Q、弱阴离子DEAE、强阳离子S之外，还有多模式的adhere和MMC。一个试剂盒套装，即可让您一次性快速筛选出最合适的离子交换填料产品。
此外，还需要选择合适的离子交换层析填料：随着分辨率的提升，反压也会随之提高，因此需要平衡分辨率/压力指标以获得最适合的分离效果。
流速：
图3：流速对分辨率的影响
受限于分离纯化不同阶段对载量、分辨率、速度的不同考量，选择经过平衡的最大流速，以获得可重复的高分辨率的分离结果。
上样量：
图4：上样量对分辨率的影响
样品量对分辨率起到主要的影响作用，因为峰的宽度同加入样品的量直接相关，为了获得满意的分辨率，上样量应不超过该层析柱的总结合载量。
洗脱梯度：
图5：理论以及实际层析分离中洗脱梯度对分辨率的影响
在方法建立的过程中，强烈建议采用线性洗脱。线性离子强度梯度很容易制备，且对于合适的层析系统该方法较容易控制与重复。当样品分辨率在可接受范围内时，采用最陡的梯度，以获得峰与峰之间最佳的分离效果。
每一次完善的清洁都是下一次完美结果的保证，因此清洗工作不容忽视。
常规清洗均可以使用NaOH或NaCl完成，例如每5次分离纯化即开启一次清洗周期。如果样品是细胞裂解液，则建议每次分离纯化都需要作一次清洗，以保证离子交换层析柱始终保持在最佳状态。
简化层析流路，减少层析纯化出口阀与收集器流路体积，有助于提高分辨率以及回收率。
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