【应用推荐】如何在3D培养的细胞中，对多个基因进行高通量定量分析？-医疗器械网

【应用推荐】如何在3D培养的细胞中，对多个基因进行高通量定量分析？

来源：赛默飞世尔科技生命科学产品分类：科技文献 2024-04-28 10:15:05 95阅读次数

近年来3D培养和细胞研究越来越热，大家对这块研究方向也越来越多样。本次应用推荐，小编带来的是Sujoy Lahiri等的《应用QuantiGene Plex对3D培养的原代人肝细胞球中ADME基因表达的定量分析》实验研究解析。

在药物研发过程中，确定药物在肝脏中诱导代谢酶的产生情况是其中的关键环节。原代人肝细胞(Primary Human Hepatocytes，PHH)是研究肝脏生物学、肝功能和药物诱导肝毒性的体外模型的金标准。然而，在传统的二维(2D)单层培养中生长的PHH会迅速去分化并在一周内失去肝脏特异性功能。而最近快速发展的三维(3D)细胞球培养可以模拟肝脏微环境并维持肝脏功能至少5周。因此，3D体外模型已被证明能更准确地反映体内肝脏生物学特征¹。

在本研究中，我们使用QuantiGene Plex检测了PHH培养的3D细胞球中42个与药物吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）和排泄（excretion）相关的基因(ADME)。其中3个标志物是核受体通路的关键标志物，通常用于鉴定对肝脏功能和代谢有诱导作用的因素：1)CYP1A2可激活芳香烃受体(AhR)激活，2)CYP2B6参与组成型雄甾烷受体(CAR)， 3) CYP3A4作用于孕甾烷受体(PXR)。然而，我们需要对ADME基因信号通路进行更广泛的评估，这有可能对于表征药物-药物相互作用及对临床结果的预测2有更好的指导作用²。

材料和方法

3D细胞球培养

采用Gibco? cryopreserved spheroid–qualified human hepatocytes进行实验(Cat. No. HMCPSQ) ，依照user Guide³实验操作指南进行操作。每孔接种3000个PHH细胞。细胞在接种后在5天内形成细胞球。从第5天开始，每48 ~ 72小时半量更换培养液1次。另外3D培养第5天，取培养的PHH 细胞在在包被了I型胶原蛋白24孔板中开始进行2D培养。操作步骤参见User manual⁴。

用原型配体诱导3个通常与肝内药物代谢相关的主要的核受体通路。

将3D、2D培养所得细胞分别用50 μM奥美拉唑(AhR配体)，1 mM苯巴比妥(CAR配体)，10 μM利福平(PXR配体)或DMSO(溶媒对照)进行处理。在第2天和第3天处理2D培养细胞，而3D培养的细胞在第6天和第7天处理(图1)。

图1. 培养5天后，原代人肝细胞形成成3D 细胞球

将Gibco? cryopreserved spheroid–qualified human hepatocytes(Cat. No. HMCPSQ)接种在Nunclon? Sphera?低附U形底96孔微孔板中(Cat. No.174925) ，在培养5天后形成3D细胞球。在第6-7天用Cytochrome P450 (CYP)处理细胞球。在第8天使用QuantiGene样品处理试剂盒QuantiGene sample processing kit (Cat. No. QS0100) 将细胞裂解。

QuantigenPlex

Invitrogen? QuantiGene? Plex分析提供一种准确精密的多重基因表达定量方法。QuantiGene Plex检测使用Luminex? xMAP?技术，可在96孔板上的单个反应孔中同时测定3-80种mRNA。QuantiGene Plex分析还整合了西门子的分支DNA（bDNA）技术。该技术通过信号放大（而非模板放大）实现对RNA转录本的直接测定。

应用Quantigen Plex检测法对定制的57个基因进行定量检测，其中包括42个ADME基因，7个凋亡基因和8个管家基因(表1)。

靶标特异性的Capture Extenders（CE）和“ZZ”Label extender（LE）与细胞裂解液和Luminex?MagPlex磁珠在54℃下孵育过夜。磁珠表面包被有捕获探针（capture probes），可特异地与CE杂交。通过这种杂交方式，每颗磁珠都与特定的目标基因杂交(原理示意图如图2所示)。过夜孵育之后，通过单链DNA寡核苷酸在50℃下依次进行的3轮杂交，每轮孵育1小时，分别杂交得到“前体放大信号”、“放大信号”和“标签探针信号”，从而形成了分枝DNA信号放大的那棵“信号树”。每轮杂交之前珠子需经过充分洗涤。标签探针寡核苷酸被生物素化，在第三轮杂交并清洗后，将磁珠与检测试剂链亲和素植红蛋白(SAPE)在室温下孵育30分钟。最后，将磁珠充分洗涤后，在SAPE缓冲液中重悬，并在3D Luminex?仪器FlexMAP上读取数据。

对于读取的数据，赛默飞官网提供的了分析软件，QuantiGene分析软件整合了Transcriptome Analysis Console 4.0.2，可在赛默飞官网登录，(apps.thermofisher.com/apps/quantigene) 。

图2. QuantiGene Plex Workflow

表1. ADME genes = Green, Apoptosis genes = Blue, HSK genes = Yellow

检测结果

图3. 分别用QuantiGenePlex和PCR技术定量检测PHH 3D细胞球，结果显示基因表达升高

用QuantiGene Plex(QGP)和实时定量PCR技术，分别检测3个批次的PHH样品(Hu186X, Hu828X和Hu826X)中CYP3A4和CYP2D6 mRNA表达水平。然后对靶基因表达水平与管家基因的几何荧光平均值进行归一化。计算3D培养的细胞与2D培养5天的细胞基因表达水平的倍数变化(Δ)。

比较各批次的3D PHH细胞与相对应的2D细胞转录本的表达水平，QGP与PCR检测结果具有良好的相关性。

图4. 原型诱导剂诱导后，检测ADME基因分别在2D和3D 培养的PHH细胞中的表达

火山图显示，奥美拉唑、苯巴比妥和利福平处理的Hu828X PHH细胞，与DMSO对照比较，基因表达水平有log2 fold的变化(p值<0.05，单因素方差分析)。基因上调>2倍的用红色标出，基因表达下调>的2倍用绿色标出。3种配体诱导后，2D和3D 培养PHH细胞的基因表达谱有显著差异。

图5. ADME基因在每种诱导剂诱导下发生特异性的差异性表达

维恩图显示了Hu828X和Hu826X PHH样本3D培养的细胞球在不同诱导剂的处理后，共同表达的基因(交集部分)和处理特异性差异表达的基因(无重叠的部分)。所列基因的Log2倍变化>2 (p值<0.05，单因素方差分析)。CYP1A2，已知是AhR激活的标记物，被AhR配体奥美拉唑特异性上调。然而，分别用于CAR和PXR活化的标记物CYP2BP和CYP3A4可被所有3种配体上调。

图6. Metapathway Biotransformation Phase I and II

QuantiGene分析软件可导出与Transcriptome Analysis Console (TAC)分析软件兼容的.chp文件。TAC软件不仅允许简单地识别差异表达，还提供强大的交互式可视化结果。TAC搜索WikiPathway数据库，允许在路径图上可视化数据，并计算路径指标。Metapathway Biotransformation Phase I and II 被确定为3种配体诱导的主要通路。由利福平上调的基因以黄色高亮标出。

结论

应用Gibco? Hepatic Spheroid Kit(A41390)，Nunclon? Sphera?低吸附U-bottom 96-孔板和Gibco?培养基添加物，可将Gibco? Primary Human Hepatocytes (HMCPSQ)在5天内培养形成3D细胞球
QuantiGene Plex数据显示，CYP3A和CYP2D在3D细胞球中的表达升高，这与通过实时定量PCR分析获得的基因表达数据趋于一致。
在用原型配体诱导后，ADME基因表达的变化在2D和3D 培养的PHH 细胞之间有显著差异。
通过ADME信号通路分析和二级标记以及/或特定基因的鉴定特征，可以提供更加全面的肝脏药物相互作用特征。

下一步方向