本文要点：详细描述微血管改变需要能够提供形态和功能信息的高分辨率3D成像方法。现有的光学显微镜工具通常用于微血管造影，但在可实现的视野和空间分辨率之间提供了次优的权衡，生物组织中的强光散射进一步限制了可实现的穿透深度。本文介绍了一种基于立体视觉结合超分辨率定位成像的体积深部组织微血管造影新方法，该方法克服了宽场成像结构中光扩散和光学衍射对空间分辨率的限制。该方法利用了第二个近红外窗口（NIR-Ⅱ，≈1000-1700 nm）中流动荧光颗粒的定位和跟踪，并通过三角测量和立体匹配两个在双视图模式下运行的短波红外相机获取的图像来增加第三（深度）维度。所提出的方法启用的3D成像功能有助于微血管网络的详细可视化和精确的血流定量。在组织模拟模型中进行的实验表明，在浑浊介质中，高分辨率可保存至4毫米的深度。整个小鼠皮层和穿透血管的经颅微血管造影在毛细血管水平分辨率下进一步显示。

背景：微循环的形态和功能变化与许多病理的发生和发展有关。激光散斑对比成像（LSCI）根据红细胞运动引起的斑点图案波动提供了二维动态血流灌注图。但LSCI覆盖的深度范围非常浅，散斑模型的模糊性进一步阻碍了血流速度的量化。多光子显微镜利用其非线性激发机制产生的光学切片能力，得益于共聚焦，3D成像可以通过沿深度的机械物镜平移，可调焦镜头，远程聚焦，或混响光学环实现，此外，线扫描可以探测流速，但仅限于小视场（FOV） 内的预选血管中，通常为＜1毫米。光学相干断层扫描已用于更深深度（≈1-2 mm）的微血管造影成像，通过检测连续B扫描之间的振幅去相关。光学显微镜方法所能达到的有限的深度和视场，促进了基于超声（US）和光声学（OA）的新的深部组织成像方法的发展。与软生物组织中的光子相比，利用超声波的微不足道的散射，这些方法实现了几mm到cm深度的高分辨率成像。超声定位显微镜进一步实现了惊人的分辨率增强（≈十倍）和并通过跟踪静脉注射的微泡同时测量平面内速度。能够检测1000-1700 nm波长范围内的光子的高效短波红外（SWIR）相机的出现为在第二个近红外（NIR-II）窗口中捕获弹道光子开辟了一条新途径，该窗口具有减少的光散射和自发荧光。宽场，共聚焦和光片显微镜NIR-II成像显著增强了成像深度，相对于在可见光或第一近红外（NIR-I）光谱下操作的其他光学方法所能达到的深度。具有高量子效率的NIR-II造影剂的开发进一步促进了深层组织成像。在本文在NIR-II窗口中提出了一种新的基于立体视觉的体积深部组织成像方法，该方法能够实现小鼠大脑的3D经颅超分辨率微血管造影。

研究内容：

1、系统设计和表征：拟议系统的示意图表示如图1a所示。外照射由855 nm激光二极管提供，而两个相同的SWIR相机用于以立体视角±20°的双视角模式收集发射的荧光信号。对于这种布置，位于不同深度的荧光目标被投射在两个传感器上的不同位置。这些投影中的每一对点都可以对分离的荧光发射器进行3D定位。具体来说，点之间的横向偏移，即所谓的视差，编码发射器在感兴趣体积（VOI）中的轴向位置，根据立体视觉参数对其进行三角测量（图1b）。利用流动荧光微滴的稀疏性，在相机采集的每张图像中以亚像素分辨率定位其中心。接下来是搜索图像校正后位于相似水平坐标的匹配点对。通过3D跟踪算法建立的流动目标轨迹叠加，最终呈现出体积图像（图1b）。与其他基于定位的成像方法一样，如光激活定位显微镜或随机光学重建显微镜，所提方法的理论分辨率受到定位精度的限制。后者是通过在平面显微载玻片上以40 Hz帧速率渲染静态微液滴的双视图图像堆栈来估计的，总采集时间为50 s。液滴局部位置的变化有助于估计最大可实现的分辨率（图1c）。请注意，微滴的尺寸小于光学系统的衍射极限，即在当前设置下为≈27.7μm，也就是说，它可以有效地被认为是理想的点源。假设局部点的分布由高斯函数很好地近似，则相应的全半宽最大值 （FWHM） 在x、y和z方向上分别为1.3、1.5和3.4 μm（图1d）。请注意，定位精度取决于信噪比（SNR），对于较大的微液滴，信噪比更高。通过获取平面棋盘图案的明场图像堆栈，进一步验证了整个FOV的系统性能，该图像使用电动载物台在3 mm深度范围内沿z轴以5μm步长平移（图1e）。黑白方块之间的交叉点在每个深度上定位，在图1f中绘制为具有颜色编码深度的点云。图1g所示的相邻平面之间估计深度偏移的直方图的平均值和标准偏差（SD）为4.8±1.4μm，与扫描步骤相匹配。为了提高深度灵敏度，需要扩大立体视觉角度，以增加样品在深度方向上的给定偏移引起的双视图之间的差异但是，增加角度会导致由每个相机的景深定义的两个体积之间的倾斜，从而导致双视图提供的体积之间的重叠减少。为了平衡深度灵敏度和有效成像体积，因此选择了±20°立体视角。这些表征测量表明，我们的方法原则上可以达到比毛细血管尺寸更好的空间分辨率，毛细血管尺寸对应于可以通过血液中的粒子跟踪成像的最小结构。

图1

2、散射介质中的三维成像性能：我们的方法在散射介质中可视化结构的能力首次在组织模拟成像中得到评估。作为原理的初步证明，我们对浸入1.2%脂质内溶液（图2a）的微管进行成像，并将其倾斜，使模型内部的深度沿y轴呈恒定梯度增加。选择脂质内浓度来模拟生物组织中散射系数的降低。通过将微液滴（直径<20μm）以恒定流速注入管道进行体积成像。以18 Hz帧速率记录了总持续时间为1分钟的双视图图像堆栈。通过叠加所有记录的帧并用青色和红色叠加在一起来获得每个相机的宽场等效图像（图2b）。沿着深度梯度，宽场等效图像的信噪比和分辨率迅速恶化，而双视图之间的位移表现出预期的线性增加。通过立体视觉定位单个流动微液滴的3D位置，重建了微管的体积视图（图2c）。图2d显示了相机1的2D宽场等效图像与使用定位方法重建的侧视图之间的比较，说明后者明显提高了散射介质中可实现的空间分辨率。正如预期的那样，还观察到计算的深度与沿y轴的横向位移之间的近似线性关系（图2e）。此外，在脂质内模型（图2f）中，不同深度重建的微管的线条轮廓在4 mm深度几乎不受影响，证实了所提出的系统的深层组织成像能力。我们用复杂的血管形状样品进一步评估了我们方法的3D性能。具体来说，将形成结图案的管道浸入1.2%脂质内溶液中的≈2毫米深度。在注射微液滴后，使用与直微管相同的参数进行双视图记录。通过叠加所有采集的帧来呈现来自每个相机的宽场等效图像如图2g所示，用青色和红色编码。在重建的图像中清楚地解析了结的3D形状（图2h）。此外，微管重叠段的239.4μm深度差，与其外径非常匹配，可以从侧视图区分开来（图2i）。

图2

3、大脑微循环的体内经颅图谱：接下来，我们展示了所提出的方法在体内小鼠皮质脉管系统经颅成像的能力。通过3D追踪流动的微液滴获得深度分辨微循环图（图3a）。请注意，从图像中心到边缘观察到的深度梯度是由于小鼠大脑的曲率（图3a）。可见深度达600μm的穿透小动脉和小静脉，如所选VOI的放大视图所示，大约Bregma -1.5 mm（图3b）。来自三个视图的相同VOI的血流速图也通过微滴跟踪呈现（图3c）。图3d显示了通过选定VOI穿透血管跟踪的单个微液滴的代表性延时双视图图像。首先，两个图像中液滴的两个投影之间的间隔距离减小，然后略有增加，这与局部3D位置观察到的深度变化一致（图3e）。作为交叉验证，通过考虑局部光斑尺寸对深度相关光扩散的依赖性，也使用单相机估计了同一微液滴的深度。虽然我们的双相机系统（基于立体视觉）和单相机系统（基于扩散）的深度估计总体上非常一致（图3f），但使用单相机系统在测量的深度中观察到更大的波动，这可能是由于生物组织的未知和异质散射特性。我们的技术实现的深度分辨能力进一步提供了基于3D跟踪的总微滴速度的更准确的估计，特别是在穿透血管中（图3g）。

图3

总结：体积定位显微血管造影提供的优势可以极大地促进微血管形态和循环的表征。本文所提出的技术能够在以前光学方法无法达到的分辨率深度范围内表征体内微血管结构。其相对简单的实施非常适合在生物医学研究界广泛传播。评估皮质微血管的已证明性能与研究中风和神经退行性疾病的根本原因和影响特别相关。此外，该方法可用于提高我们对微循环变化在癌症，糖尿病，心血管疾病和其他病理状况中的作用的认识。

参考文献

Zhou, Q.; Nozdriukhin, D.; Chen, Z.; Glandorf, L.; Hofmann, U. A. T.; Reiss, M.; Tang, L.; Dean-Ben, X. L.; Razansky, D., Depth-Resolved Localization Microangiography in the NIR-II Window. Adv Sci (Weinh) 2022, 10 (1), e2204782.

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