本文要点：通过单个荧光团同时检测不同的疾病具有挑战性。本文报告了一种名为Cy-914的双色荧光团，利用其NIR-I / NIR-II双色成像功能同时诊断非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和转移性肠癌。pKa为6.98的Cy-914对pH值和粘度都具有高敏感性。在酸性肿瘤微环境中，795 nm处显示NIR-I荧光，同时在中性至微碱性条件下914/1030 nm处显示强烈的NIR-II荧光。此外，Cy-914可以灵敏且无创地监测NAFLD进展过程中的粘度变化。更重要的是，它能够在两个独立的通道中同时显示NAFLD（ex / em = 808 / 1000-1700 nm）和肠道转移（ex / em = 570 / 810-875 nm），且局部喷洒后没有光谱交叉干扰，进一步改善了小于3 mm的微小转移灶的荧光引导手术。

背景：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）正在成为最常见的以肝细胞脂肪变性为特征的慢性肝病，在全qiu成人中患病率为25%。如果NAFLD没有及时诊断和治疗，它将有发生肝硬化和肝癌的风险；同时，由于转移性肿瘤体积小、血管化程度低、分布散，检测和切除转移性肿瘤具有挑战性。迄今为止，常规超声、磁共振成像和计算机断层扫描已被临床用于NAFLD 和肠癌的诊断。然而，这些方法只能提供解剖学和病理学图像，在灵敏度，空间分辨率和安全性方面受到限制。因此，仍然需要在分子水平上开发高度灵敏和特异性的诊断方法，以便早期准确地检测NAFLD和转移性肠癌，进一步防止其恶化并改善其治疗。近红外区域（NIR-I：700-900 nm，NIR-II：1000-1700 nm）的荧光成像由于其高灵敏度，良好的时空分辨率和无创可视化（特别是在NIR-II窗口中）具有巨大的潜力，由于光子散射和自发荧光减少，可提供更高的空间分辨率和更深的体内组织穿透。因此，可以响应生物标志物和细胞微环境的智能可激活NIR荧光探针有望用于NAFLD和转移性肠癌的早期准确诊断。

研究内容：作者首次开发了三种具有双色成像能力的双色荧光团（BCFluors），用于NAFLD和转移性肠癌的体内诊断。每个BCFluors都由供体-π-受体（D-π-A）结构，双键桥接转子和苯酚基组成，分别实现强烈的荧光发射，对粘度的敏感响应和对pH的快速响应。通过对π共轭骨架的扩展，产生了一个名为Cy-914的NIR-I /NIR-II BCFluor，具有可调的激发和发射光谱。在酸性肿瘤微环境中，pKa为6.98的Cy-914在570 nm激发下795 nm处显示开启NIR-I荧光。同时，在微碱性粘稠环境中，Cy-914的峰值吸收将红移至819 nm，进一步触发914/1030 nm处的强NIR-II荧光，由于酚羟基的去质子化和增强的分子内电荷转移机制，在1200 nm处尾部发射。随着粘度的增加， Cy-914 在 914 和 1030 nm 处分别显示出 72 倍和 53 倍的荧光增强。（Figure.1）

Figure1

三种BCFluors的设计和合成路线Fig.2a所示。作者选择了具有D-π-A结构的半菁来构建具有较大斯托克斯位移的BCFluors。BCFluors（Cy-700，Cy-805和Cy-914）是通过简单的克脑文盖尔缩合反应合成的。为了使其对pH敏感，将酚基与骨架链接以调节不同pH条件下的荧光发射波长。为了使其对粘度敏感，受体1-乙基苯并[c，d]碘鎓和供体苯酚通过一到三个旋转双键桥接。在低粘度介质中，这样的D-π-A结构可以自由旋转，导致激发态的强非辐射衰变。反之，在高粘度时，由于分子内自由旋转受限，则会引发强烈的荧光。Cy-700、Cy-805 和 Cy-914 具有pH/粘度响应的双色成像能力，在酸性 pH 缓冲溶液中分别在 617、700 和 795 nm 处表现出荧光发射最大值，在微碱性粘稠条件下分别在 700、805 和 914/1030 nm 处表现出峰值发射（Figure.2bc）。此外，Fig.2e总结了这些BCFluors的pKa分别在6.30、6.89和6.98的其他光谱特性。为了进一步了解随着双键数的增加而波长的红移，使用DFT计算了三个BCFluors的HOMO和LUMO能级（Figure.2d）。它们在整个D-π-A骨架上的离域HOMO和LUMO相似，而它们的HOMO-LUMO带隙差异明显，分别为2.52、2.22和1.99 eV，表明通过双键扩大π共轭系统可以有效地缩小能隙，并以显著的红移导致NIR吸收和发射。

Figure2

作者继续验证Cy-914的光谱特性。由于它具有很高的 NIR-I/NIR-II 双色成像潜力，首先测量了 Cy-914 在不同 pH 缓冲溶液中的吸收和发射光谱。如Figure.3a所示，Cy-914在酸性和碱性条件下表现出显著不同的光谱性质，在pH 5.0柠檬酸盐缓冲液中，在570/795 nm处显示出峰值吸收/发射。在pH值为8.8的柠檬酸盐缓冲液中，由于酚羟基的去质子化和增强的细胞内电荷转移过程，分别观察到720和914/1030 nm处的峰值吸收和发射。为了进一步检验其对肿瘤酸性pH的敏感性，进行了pH滴定。随着pH值的降低，720 nm处的吸收消失，570 nm处的峰值吸收出现，在795 nm处的峰发射逐渐增加，pKa为6.98，浅绿色溶液变为紫色（Figure.3bc）。同时，Cy-914通过在3.0和11.0之间交替改变pH值，即使在五个循环后也具有出色的pH可逆性（Figure.3d）。更重要的是，Cy-914表现出良好的化学稳定性，不受金属离子，氨基酸和活性氧等常见生物物种的干扰。其中，只有质子能够在795nm处触发强烈的NIR荧光（Figure.3e）。值得注意的是，Cy-914在不同pH缓冲液中的荧光图像表明，它能够进行双色成像，在酸性条件下显示NIR-I荧光，以及在中性或微碱性pH下显示NIR-II荧光（Figure.3f）。接下来，为了进一步研究Cy-914对粘度的敏感性，作者检查了探针在不同比例的水 - 甘油混合物中的吸收和荧光发射光谱。在非粘稠水（pH 8.0）中，由于分子内自由旋转，在914nm处观察到非常弱的荧光。相反，在914/1030 nm处呈现出强烈的NIR-II荧光，并随着粘度从0.89 cP（100%水）而逐渐增加到163.60 cP（90%甘油），在914和1030 nm处分别表现出72倍和53倍的荧光增强（Figure.3gh）。作者进一步测试了Cy-914在具有不同极性的不同溶剂中的荧光光谱，只有高粘度才能打开其强烈的NIR-II荧光（Figure.3i）。
Figure3

由于Cy-914是一种NIR-I/NIR-II成像染料，其发射波长超过共聚焦显微镜的范围，作者接下来使用Cy-700进行双色细胞成像，因为它们具有相似的pH/粘度响应（Figure.4a）。为了检查Cy-700的细胞器靶向能力，将HeLa细胞与Cy-700和线粒体绿色荧光探针一起孵育。如Figure.4b所示，红色通道和绿色通道融合得非常好，皮尔逊系数高达0.91。Cy-700具有良好的线粒体靶向能力，进一步应用于HeLa细胞的线粒体粘度成像。制霉菌素是一种众所周知的药物，可以破坏线粒体功能障碍并诱导粘度变化。当细胞单独与Cy-700一起孵育时，红色通道中的微弱荧光（λex：637 纳米， λem：663-738 nm）被观察到(Figure.4c）。相比之下，当用制霉菌素预处理细胞时，显示约2.5倍的红色荧光增强（Figure.4e）。为了进一步研究其体外双色成像能力，作者应用Cy-700监测线粒体自噬的pH变化。首先将HeLa细胞与Cy-700孵育2小时，然后用无血清培养基处理以用于饥饿诱导的线粒体自噬。绿色通道中的荧光信号 （λex：487 纳米， λem：570-620nm）显著增加，饥饿3 h后荧光增强2.3倍（Figure.4df）。接着进一步评估Cy-914在体外检测酸性pH和粘度的能力。如Figure.4gh所示，由于pH值降低，负载Cy-914的细胞在饥饿诱导处理时表现出较高的NIR-I荧光，同时，由于线粒体粘度增加，制霉菌素处理的细胞表现出强烈的NIR-II荧光。

Figure4

接下来应用Cy-914来跟踪NAFLD小鼠模型中的粘度变化。NAFLD小鼠模型是通过喂食高脂肪饮食（60千卡%脂肪）和注射地塞米松建立的。然后，在第5天，第10天和第15天将小鼠注射Cy-914，第0天小鼠为正常饮食的对照组。与正常小鼠相比，不同程度的脂肪肝小鼠表现出显着更高的NIR-II荧光，特别是在第10天，高信背景比为2.6 / 1。此外，由于腹部脂肪的增加和光穿透的衰减，第15天的NAFLD小鼠显示出荧光略有下降（Figure.5ab）。为了进一步验证NAFLD的成功产生，在选定的日期分离小鼠的肝脏。正常的肝脏呈现深红色，表面光滑;相比之下，NAFLD组中扩大的肝脏显示出黄色，表面油腻，肝脏中显示出更强的NIR-II荧光，高达1.9倍（Figure.5cd）。此外，苏木精和曙红（H&E）染色进一步验证了NAFLD模型的成功建立，显示肝细胞肿胀和肝索紊乱（Figure.5e）。为了进一步检查生物分布，在注射后1小时通过NIR-II荧光成像收获并分析主要器官（Figure.5f）。Cy-914在肝脏和脾zang中表现出强烈的NIR-II荧光，并且由于粘度随着脂肪肝的进展而增加，只有肝脏显示出增强的NIR-II荧光（Figure.5g）。

Figure5

最后，建立了携带NAFLD和转移性肠癌的小鼠模型。如Figure.6a所示，首先用高脂肪饮食喂养小鼠并注射地塞米松以诱导脂肪肝，并在第5天，腹膜内注射用荧光素酶表达的4T1-Luc细胞以产生转移性肠肿瘤。在腹部观察到显着的生物发光信号，表明成功产生肠道转移（Figure.6b）。在肝脏和肠道表面局部喷洒Cy-91430秒后，强烈的NIR-II荧光（λex：808 nm， λem：1000-1700nm）在脂肪肝中快速清晰地观察到，显示出比正常肝脏高1.6倍的荧光，同时在腹部有显著的NIR-I荧光信号（λex：570nm，ICG通道）伴有肠道转移，显示1.9倍高的荧光（Figure.6bc）。为了进一步检查离体荧光，收获了实验组和对照组的肝脏和肠道，在脂肪肝中表现出强烈的NIR-II荧光，在转移性肠肿瘤中表现出NIR-I荧光（Figure.6d）。值得注意的是，通过利用局部喷洒和NIR荧光引导手术，可以清楚地检测到小于3 mm的微小肠道转移并精确切除，通过生物发光成像和H&E染色分析进一步证实（Figure.6e）。

Figure6

总结：作者成功设计并合成了BCFluor，Cy-914，具有pH和粘度响应特征，用于体内双色疾病诊断，没有光谱交叉干扰。探针Cy-914通过响应pH/粘度表现出可调谐的NIR-I/NIR-II荧光，在酸性微环境中显示出显著的NIR-I荧光（795 nm），在中性至微碱性条件下表现出强烈的NIR-II荧光（914/1030 nm）。值得注意的是，它能够通过利用NIR-II荧光成像来灵敏且无创地监测NAFLD进展中的粘度变化。更重要的是，Cy-914允许在局部喷洒后在两个独立的通道中同时检测NAFLD和转移性肠癌，进一步改善了荧光引导下小于3mm的微小肠转移的手术切除。该研究为通过单个荧光团进行多疾病诊断提供了一种新颖的策略，Cy-914有望在未来用于检测其他pH/粘度相关疾病的应用。

参考文献

doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03100

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