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【显微课堂】高质量超薄切片：自动对刀

来源：徕卡显微系统(上海)贸易有限公司分类：选购指南 2024-05-09 13:15:11 64阅读次数

如何提高超薄切片机的切片质量

并实现自动对齐功能

超薄切片技术是获取样品切片的最常用方法。在室温条件制备时，将样品小块嵌入环氧树脂中，然后通过修剪去除多余的树脂，并使用玻璃刀或金刚石刀将样品切成厚度为50-100纳米之间的薄片。

切片过程涉及多个手动制备步骤。在本应用说明中，我们将概述该过程，并解释新的自动化解决方案，如何完全消除复杂的手动设置需求。

简介

透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）等电子显微镜技术，广泛应用于获取生物或非生物材料样品的结构信息。在电子显微镜（EM）应用中，较厚的样品被切割成厚度小于100纳米的超薄切片。

该样品制备方法有助于获取高分辨率的电子显微镜图像，并且能够进一步通过计算重建从多个连续切片中收集的信息，从而获得较厚样品的概览（体积电子显微镜学）。

样品块的修整

为了获得具有特定厚度的均匀切片，必须执行多个手动步骤，并具备相应的技能和专业知识。

粗修

在切割感兴趣区域之前，必须对样品进行初步修整，以露出目标点，并去除过量的无样品聚合物或非目标样品区域。通常，修整的结果是形成（堆叠的）金字塔形状，其尺寸逐渐减小（图1）。

图1：经过粗修和精修后的样品块。放大图显示了聚合物块前端上的样品面。聚合物块前端面使用铣削装置，以45°的形状进行修整。使用超薄切片机和具有45°边缘的切片刀对块面进行修整，形成金字塔形状。

首先，粗修是通过手动使用刀片或使用EM RAPID来制备金字塔截体。EM RAPID的高速金刚石铣削头，可以以特定角度朝向样品，同时样品在四轮中能够进行90°旋转（图2）。

图2：使用EM RAPID铣削装置对样品块进行粗修。左：修整前的样品块。中：铣削第二个区域。右：最终粗修后的样品。

精修

接下来，将样品块安装在超薄切片机上，并使用修块刀减小样品区域并塑造其形状，以形成最终的切面。精修的目的是将样品感兴趣区域包含在小于1平方毫米的矩形或梯形区域内，并使上下边缘与切片刀完全平行（图3），这将在后续步骤中允许切片彼此粘附形成带状。带状切片可以整体收集，使用户能够按照切片的顺序进行拍摄，这对于阵列断层扫描应用尤其重要。

图3：使用金刚石修块刀进行精修。左：粗修后的样品块。中：精修前样品块的前端。下方可见一把45°金刚石修块刀。右：样品块面的前端和右侧已经进行了精修。

样品与切片刀之间对齐

在对样品块进行修整以获得平坦且暴露的块面后，将其正确对齐到切片刀边缘至关重要。最终目标是使样品与切割平面之间的距离尽可能小，以避免样品材料损失和切片不完整。

完美对齐样品和切片刀是一项具有挑战性的任务。它需要精密地手动调整样品倾斜、旋转和切片刀角度，同时需要正确地控制样品进给（进刀）。

这对于新手或不常使用超薄切片机的用户来说尤其困难。不仅存在损坏昂贵切片刀的风险，而且还可能损坏样品，无法用于切片。即使经验丰富的操作人员也需要小心谨慎，以确保在较薄样品（如细胞单层）切片过程中，不会因初始位置未对齐，而损失太多材料。

方法

为了判断切片刀与样品之间的距离，用户需要使用底照光来观察它们之间的间隙，整个过程在体视显微镜下进行。底照光从下方照亮切片刀的背面，并通过样品块面的光滑表面反射光线，呈现为一条明亮的条纹（图4）。这被称为“光隙”。

完美对齐表现为在整个块面长度上均匀宽度的薄（蓝色）光隙（见下文）。

图4：切片刀背面在样品块面上的反射图像。左：概览图，底照光被切片刀的背面反射至样品块面，几乎照亮了整个前端面。右：用切片刀接近样品时，块面上的反射光变成小条纹，称为光隙。光隙是指示切片刀与块面之间方向的工具。

以下步骤通常以迭代顺序执行，直到块面和切片刀对齐为止。通常，两者之间的距离可以小于500纳米。

样品旋转

为确保切片能够彼此粘附并形成带状，切片的上下边缘必须完全平行。这只有在整个块面与切片刀完全接触时才能实现。因此，必须旋转样品以使其与切片刀边缘平行（图5）。

图5：调整样品旋转。左：样品旋转与切片刀边缘的示意图。中：样品未正确旋转。右：样品正确对齐到切片刀。

首先，将切片刀座移至足够接近样品的位置，以产生光隙。一旦在块面上观察到光隙，用户需要调整样品旋转，使块面下边缘与切片刀平行。如果未调整切片刀角度，可能无法使样品和切片刀平行，因为块面尚未被修块刀修整。

切片刀角度

为了补偿块面表面与切片刀之间的角度，需要旋转切片刀，直到块面的前导边缘与切片刀平行（图6）。这将确保样品从左到右的整个区域与切片刀接触，从而提供完整的切片，不会损失太多样品材料。此外，上述操作确保样品切割均匀，并使切片能够彼此粘附，在切片刀水槽中形成条带（图6，下图）。

图6：调整切片刀角度。左上：切片刀和样品块面的示意图。蓝色切片刀以其边缘与块面平行的方式转动。中上图像：底照光照亮的块面图像。切片刀边缘在图像底部可见为黑色条纹。切片刀边缘必须与块面的下边缘平行，但在这里并非如此。右上图像：调整切片刀角度，使其与块面边缘平行。下图像：切片在切片刀水槽中形成条带。切片具有完全平行的边缘，因此彼此粘附。

样品倾转

样品倾转是最关键但不易观察的影响参数之一。如果样品倾转不正确，切片刀在切割过程中将不会与样品运动保持一致。因此，在获得完整切片之前，可能会丢失珍贵的样品。

通过弧形样品夹以调整块面与切片刀边缘之间的角度，可以调节样品倾转。以光隙为指标，用户在调整过程中需要上下移动样品，直到光隙在整个块面上显示相同的厚度（图7）。

这需要通过迭代方法来调整样品倾转。在这个阶段，切勿将切片刀太靠近样品，否则块面的离切片刀较近部分可能会被完全切掉，从而有损失整个样品的风险。同时，也存在切片刀损坏的风险。

图7：调整样品倾转。左：样品倾转原理的示意图。样品倾转，直到块面表面沿切割运动方向与切片刀边缘对齐。中：上下移动样品时的两个光隙图像。灰色条纹的厚度不同。右：调整后的光隙。

以光隙为作为调整的指标

样品和切片刀角度调整的最后一步是使用光隙作为指标进行调整。在调整样品倾转之后，小心地将切片刀朝样品推进，直到切片刀与块面之间的光隙几乎看不见。在接近过程中，光隙的颜色会发生变化，直到最终变为蓝色（颜色的变化是衍射的结果，图8）。使用这种方法，在整个块面上对齐偏差能够小于1μm。从块面反射出的蓝色光隙，通常表示块面与切片刀之间的距离约为400纳米。在此距离下，在所有角度上均匀分布的光隙是最精确指标，尽可能减小材料的损失。

图8：精细调整过程中，切片刀与块面之间衍射产生的蓝色光隙。

图9：带有电动切片刀架（1）和弧形样品夹（2）的UC Enuity

内置的flexacam（i5或c5）相机，提供了切片刀和光隙的图像，这些图像会被分析，并将信息发送回来，以进行自动对齐工作（图10）。

图10：内置flexacam i5相机和触摸屏截图，显示带有自动对齐反馈线的图像（也见下文）。

对齐过程会引导用户完成接近阶段，最终对齐步骤将自动完成。这种自动化设计旨在保护切片刀和块面免受损坏，同时帮助用户实现完美对齐。该功能帮助未经过培训的用户，如在核心设施或研究组内工作的用户，在切片刀和样品的初始定位阶段，在不承担损坏风险的情况下获得高质量切片。

需要注意的是，要执行完全自动对齐功能，必须满足某些先决条件。例如，块面尺寸必须至少为250 x 250μm，最大为1200 x 1200μm。此外，块面必须具有反射性且足够干净。

自动化工作流程

开始自动对齐程序前，首先应将切片刀接近块面并居中。在用户确认后，将执行自动对齐功能（图11）。

图11：UC Enuity显示屏截图，显示检测光隙步骤中的相关交互按钮（左）。自动对齐过程中的相机图像（右）。反馈线指示图像中是否检测到正确的边缘。绿色：垂直中心线；洋红色：光隙的上边缘；白色：光隙的下边缘（此处不可见，与红线重合）；红色：切片刀边缘；蓝色：自动检测到的块面左边缘和右边缘。

软件检测图像中的不同边缘，并对切片刀角度、样品倾斜和样品旋转进行迭代对齐。在此过程中，样品会上下摇动，以观察分析整个块面范围的光隙，并据此调整样品倾斜。

在过程结束时，可以自动将切片刀接近样品，直到大约5μm的距离（图12）。如果需要，也可以进行手动校正。

图12：切片刀接近样品，安全距离约为5μm。左：对齐后，用户可以决定自动或手动接近样品。右：接近后的光隙。将保持约5μm的安全距离。

多组测试结果

对齐过程的目的是避免在获得完整切片之前，不必要地损失部分样品区域。为了提供确凿的证据，证明自动对齐功能能够可靠地产生高质量切片，我们对样品进行了一系列超薄切片测试。

在第一组代表性样品中，专家手动进行了对齐。通常，专家需要切割5-10个厚度为100nm的部分切片，直到获得完整切片。另一组样品使用UC Enuity的自动对齐功能进行修块，其中五个不同样品使用不同设备进行修块，样品块面尺寸不同。在两组测试中，部分切片的平均数量均低于或等于10，而最少部分切片的数量在3到7之间（表2）。这证明使用UC Enuity可以成功实现自动对齐。

表2：使用UC Enuity自动对齐后获得完整切片所需的部分切片数量。

测试1，n=4；测试2，n=2；测试3，n=4；测试4，n=7；测试5，n=2。

总结

在超薄切片中，切片刀和样品的对齐，对于实现高质量切片和减少获得完整切片前的样品材料损失至关重要。

由于对齐过程较为复杂，手动操作时需要用户具备丰富经验，因此UC Enuity提供的自动对齐解决方案，有助于减少非熟练和不常用户对样品或切片刀造成损坏的风险。UC Enuity还帮助他们实现完美的光隙调整，为高质量的切片提供了基础。

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