AccuSizer?用于蛋白质配方优化的自动颗粒计数分析，以最大限度低减少聚集并执行USP<787>亚可见颗粒物测试。

关键词:动态光散射;AccuSizer?系统;自动颗粒计数

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动态光散射 （DLS） 是确定蛋白质粒径的标准工具，但该方法不提供浓度信息。AccuSizer? 单颗粒光学计数（SPOS） 系统是测定大于 150 nm 的聚集蛋白大小和浓度（以颗粒/mL 为单位）的理想技术。图 1 显示了对单克隆抗体进行热应激前后的 Nicomp? DLS 结果。蓝色的谱图为应力后结果，显示了高分辨率的多峰结果，包括从~150 nm开始的较大聚集峰。AccuSizer 无法检测低至 10 nm 的单体尺寸，但可以提供指示聚集程度的>150 nm颗粒计数的定量数据。在这项研究中，AccuSizer FX Nano 用于研究各种制剂配方稳定剂如何影响 NIST 标准蛋白的最终聚集状态。同时，AccuSizer 粒子计数器也可用于 USP <787> 亚可见颗粒物测试。¹

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使用的蛋白质是 NIST 参考物质 8671，批号 14HB-D-002，NIST mAb，人源化 IgG1k 单克隆抗体。²

使用 35 mW 半导体激光光源 ，APD 检测器在 Nicomp 动态光散射 （DLS） 系统上测量蛋白质的整体大小。蛋白质聚集体（团聚）在配备两个传感器的 AccuSizer FX Nano SIS 系统上测量：

图 1.热应力前后的Nicomp DLS结果（紫色-应力前；蓝色-应力后）

传感器：

LE-400型：0.5 – 400 μm

FX Nano：0.15 – 10 μm。

SIS 进样器可提供低至 100 μL 的精确微量进样，并具有样品回收功能。

iFormulate³（图2）板预装了由美国能源部设计的用于配方开发的配方，用于测试作为配方化学函数的团聚水平。采用多变量实验设计，评估了蛋白质制剂的四个主要变量：pH值、离子强度、缓冲液和稳定剂浓度对团聚的影响。

图 2. iFormulate 板

使用的 iFormulate 板测试了以下变量：

?       pH: 5 – 7.6

?       离子强度: 0 – 200 mM NaCl

?       trehalose 稳定剂: 0 – 10 %

?       缓冲液浓度: 10 – 50 mM

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解冻 NIST mAb 并稀释至 1 mg/mL。 首先将 160 μL 过滤的去离子水加入到 iFormulate 板的每个孔中。接下来，向每个孔中加入 40 μL NIST mAb。将板置于 60°C（略低于蛋白质熔点）的烘箱中 24 小时。使用AccuSizer粒子计数器分析每个孔>0.15 μm（总计）和> 0.53 μm的颗粒计数数据并提交给iFormulate，然后iFormulate进行数据分析和稳定性建模。

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使用Pareto分析方法处理数据，这是一种正式的技术，当存在许多可能因素应用最后结果的情况下非常有用。Pareto分析给出了变量的排名和变量之间的交互作用。图 3 和图 4 分别显示了 >0.15 μm 和 >0.53 μm 的Pareto分析。颜色表示配方变量对增加颗粒计数的相对重要性，蓝色 = 显著，灰色 = 临界线，红色 = 不太显著。

Pareto对总结果影响

图 3. >0.15 μm 的Pareto影响（总计）

Pareto对MT0.53微米的影响

图 4. >0.53 μm 的Pareto影响（总计）

接下来的结果（如下所示）显示了不同条件下的聚集效应的 3-D 响应面图。这种设计空间的经验视图提供了优化理想配方的功能，用以识别在两个尺寸范围内较多的颗粒计数来获得最小化聚集的配方。图 5 和图 6 显示了在保持缓冲液和 NaCl 浓度恒定的情况下改变 pH 值和稳定剂（trehalose）的结果。

图 5. pH值和稳定剂对>0.15μm颗粒浓度的影响

图 6. pH值和稳定剂对>0.53μm颗粒浓度的影响

图 7 和图 8 显示了在保持缓冲液浓度稳定且 pH 值在 5.91 至 6.3 之间略有变化的情况下，改变 NaCl 和稳定剂（trehalose）浓度的结果。

图 7. NaCl和稳定剂对>0.15μm颗粒浓度的影响

图 8. NaCl 和稳定剂对 >0.53 μm颗粒浓度的影响

然后对这些结果以及此处未显示的其他结果进行编译，以创建图 9 和图 10 所示的最小粒子计数优化图。

总计 x 10^6

图 9.>0.15 μm颗粒浓度最小化图

MT0.53微米 x 10^3

图 10.>0.53 μm颗粒浓度最小化图

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此处显示的结果表明，最大限度地减少颗粒计数和蛋白质聚集的最佳配方化学成分是：

pH = 6.1 – 6.3

NaCl = 40 – 70 mM

trehalose = 7 – 8%

Buffer = 50 mM