6 毫米蓝宝石盘需要在实际实验前进行清洁。清洗步骤如下：

在将细胞种植到组装好的 SampLink 细胞室之前，需要再次对细胞室进行清洁和灭菌。在细胞培养罩中执行以下步骤：

SampleLink即可使用。将细胞直接种在蓝宝石上，或种在附加的聚合物或多肽涂层上。在这里，蓝宝石上的碳网格图案上涂有聚-L-赖氨酸（broid P1274，分子量 70,000-150,000 ，Sigma-Aldrich）。涂层用 0.1 mg/ml dd H₂O 稀释。在每块蓝宝石上加入 50μl 5 分钟，然后冲洗（3 次 dd H₂O），并在通风橱中干燥 2 小时。

这些实验使用了在 DMEM 培养基（10 % FCS ，1 % 青霉素/链霉素）中培养和孵育的 HeLa Kyoto HKF1、H2B-mCherry、alphaTubulin、mEGFP 细胞系。

每个SampLink chamber培养66,000个细胞，在37°C、5% CO₂ 条件下培养 24 小时。

在标准细胞培养箱中，将 6 个开放的 SampLinks 放入 140 毫米的培养皿中，然后盖上培养皿。在实际成像实验之前，需要将 SampLinks 完全组装好。按照 Coral Life 手册第 5.2.4 节的说明组装 SampLink 室。

如果直接在 OxyGenie 中培养 SampLinks，则需要在播种后直接组装 SampLinks chamber。注意：OxyGenie 需要 30 分钟左右加热。

在这些实验中，培养 24 小时后细胞的密度达到约 70%。

一旦细胞达到所需的密度，6个SampLink  chamber就可以安全地从细胞培养实验室转移到显微镜实验室。

若THUNDER显微镜与SampLink  chamber一起用于成像，以下是一些关于成像参数的提示和技巧：

设置平台的转移位置，以便之后轻松卸载SampLink chamber进行冷冻。

根据网格图案手动识别蓝宝石片中心（见图2）。

确定后，从中心开始快速螺旋扫描，覆盖整个区域，以获得初步的快速概览。这样可以快速检查方向。此处直接使用 40x 水浸物镜。

为了进一步识别感兴趣的区域，还进行了带焦点图的螺旋扫描。这样做的好处是，如果蓝宝石片或chamber不完全平整，焦点就会得到修正。可以在多个通道中创建带聚焦图的序列扫描（图3）。建议逐个通道运行，完成后再合并。

完成后，确定感兴趣区域 (ROI)，如图 4 所示。每块蓝宝石片可以使用一个以上的 ROI 进行下游分析。但必须确保区域之间有足够的空间，以便修整或分割树脂块。

在本示例中，观察从细胞分裂开始。60 分钟后固定样本。根据相关过程的动态变化，您需要选择不同的成像时间间隔。就本文而言，每分钟 1 张图像足以跟踪细胞分裂和脱落。

本例中使用的是整体冷冻替代方案。这种技术可在样品内部进行强烈的金属染色，从而在扫描电镜成像时获得良好的对比度。它也可用于 TEM 成像；不过，由于脂质上的强金属堆积，分辨率会略有降低。在高倍放大镜下，样品会显得模糊不清。所使用的冷冻替代液含有 1% OsO4 + 0.2% 醋酸铀酰 + 2.5% H₂O 的纯丙酮。

将样品在液氮下放入冷冻替代液中，然后转移到-90°C的预冷 EM AFS2 系统中：

包埋完成后，将通流环 (16707161) 放入试剂槽 (16700154) 并注入一半的新鲜树脂。将蓝宝石转移到通流环中，用体视显微镜检查finder栅格的可读性（图5）。然后，将通流环完全填满，并将样品放入 60°C 的烘箱中 48 小时。

工作流程中最关键的步骤之一是取回树脂块中的 ROI，然后进行修块和成像。为了检查样品是否保存完好，建议在聚合后对树脂块的块面进行快速成像。在本实验中，将光学显微镜的数据与树脂块表面的图像进行了如下关联：

注：在高压冷冻过程中，单个细胞或有时成批细胞从蓝宝石上脱落是正常现象。高密度或与基底结合不牢固的细胞（即有丝分裂细胞，因为它们会变圆，因此与基底的附着点会减少）会产生这种效果。使用较低的细胞密度和/或不同类型和浓度的涂层可以减少玻璃化过程中细胞的损失。

然后将蓝宝石从块面上剥离：

利用finder栅格的网格图案，您可以在区块上找到 ROI 并将其修剪下来。在这里，使用 EM TRIM2 对包埋块进行了修整。

在本例中，由于只有 5-7 个部分包含目标特征，因此必须进行序列切片。因此，切片被安装在slot grids上。由于使用了整体冷冻替代和渗透方案，因此无需进行后期染色。

本实验使用THUNDER技术对原始数据进行后处理。要了解有关THUNDER技术的更多信息，以及如何在 Coral Life 工作流程中使用THUNDER技术进行后处理和定位，请扫码查阅应用说明：“如何使用 Coral Life 改进活细胞成像”。

最终的图像相关性取决于每个实验的要求，可以是将不同的图像结果并排放置，也可以是更详细的二维和三维图像相关性，从而提取超微结构和活细胞数据之间的关系。在本例中，创建了 LM 和 EM 数据的叠加。为了进行匹配叠加，需要在光学显微镜和电子显微镜图像上放置地标。为此，需要叠加无褶皱变形的图像。

光学显微镜和电子显微镜图像的叠加。