日前，国家药监局、国家卫生健康委联合发布《中国药典》（2020年版）第一增补本，将于2024年3月12日起施行。其中增加了《9405 糖蛋白的糖基化分析指导原则》，本指导原则详细阐述了糖蛋白糖基化分析的理念、方法及应用和验证的相关要求，适用于糖蛋白产品结构与稳定性的表征、批次放行检测和过程控制检测以及产品间可比性评估等。本指导原则的实施，将进一步指导广大生物制药用户对糖蛋白糖基化的分析。

糖蛋白的糖基化是通过糖基受体、糖基供体和糖基转移酶三种分子的协同作用将单糖或寡糖以糖苷键形式连接在蛋白质的氨基酸残基上，是蛋白质的一种翻译后修饰。糖蛋白的糖基化结构复杂，且在生物合成过程中可受多种因素影响产生异质性，糖基化对治疗糖蛋白的功能、药代动力学、药效学、稳定性和免疫原性等有着显著的影响。因此糖基化分析对于药物开中的活性成分鉴定及产品质量控制等具有重要意义。《9405 糖蛋白的糖基化分析指导原则》包含的分析内容及方法如下：

糖蛋白糖基化分析的挑战主要涉及以下几个方面：

• N-糖基化：其修饰的目标序列具有保守性，拥有相同的五糖核心结构，可以采用一种通用酶（如PNGase F酶）将N-糖酶切，分析较为容易；

• O-糖基化：没有特征的修饰序列可做修饰位点的预测，并且O-糖基化的糖基结构比较复杂，分析难度较大。

LC-MS方法能够从完整蛋白、糖肽和游离寡糖三个水平对蛋白药物的糖基化修饰进行深度全面的分析，然而不同分析策略的侧重点会有差异，并且对高分辨质谱仪器具有很高的要求，具体如下：

高分辨质谱ZenoTOF 7600 系统是在2021年推出的全新三合一高分辨质谱仪（如图1），除了延续高分辨质谱系统分辨率高、质量精度高、稳定性好、采集速度快的优势之外，还整合了2项革命性的创新技术电子活化解离（Electron-activated dissociation，EAD）技术和ZenoTrap（Zeno阱）富集技术。高分辨质谱ZenoTOF 7600 系统提供的EAD技术碎裂能量连续可调，可以实现一系列基于电子的碎裂机制，产生丰富的二级碎片。并且，EAD技术无需试剂就可以产生电子裂解，使用非常方便。ZenoTOF 7600 系统配备的Zeno阱富集技术，能够提供接近100%的高占空比，二级离子利用率高，可以提升10-20倍的灵敏度。

ZenoTOF 7600 系统的硬件特点及在蛋白药物糖基化分析中的主要应用优势如下：

本文以高度糖基化的复杂蛋白药物如重组人促红细胞生成素（rhEPO）、重组人血小板生成素（rhTPO）、依那西普（Enbrel）等样品为例，分别从三种不同分析策略下对蛋白药物糖基化的表征，充分体现出ZenoTOF 7600 系统在蛋白药物糖基化分析中的技术优势。

图2主要展示了三种高糖基化蛋白药物（rhEPO、rhTPO、Enbrel）中携带不同类型以及不同个数O-糖的糖蛋白整体分布情况。EPO含有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点，糖链约占总分子量的40%。从完整蛋白水平上进行O-糖基化分析时，可采用PNGase F酶切除N-糖，降低EPO样品的异质性。与EPO类似，rhTPO和依那西普的异质性也非常高，但是不同点在于rhTPO和Enbrel的异质性主要表现为含有较多的O-糖基化位点，并且O-糖中存在较高比例的唾液酸化。因此，在实验前处理中除了需要去除N糖外，还需要去除O-糖外端的唾液酸，进一步降低rhTPO的异质性，从而提高完整蛋白分析中一级谱图的质量。通过对去卷积谱图进行分析，rhEPO中主要的O-糖型为Core1_S1和Core2_S2；rhTPO中的主要O-糖型为Core1；Enbrel中的主要O-糖型为Core1和Core2。此外，根据完整蛋白去卷积谱图的峰面积还可以计算出O-糖基化修饰的比例。

如图4A所示，在CID碎裂模式下，糖苷键会更容易断裂，寡糖部分优先碎裂，降低了肽段的碎裂效率。如图4B所示，ZenoTOF 7600 系统特有的EAD技术可以最大程度上保留二级离子中糖链的完整性以及糖链与肽段之间糖苷键的完整性，肽段部分能够产生丰富的二级离子，从而提升了肽段骨架的二级离子覆盖率，有利于糖基化位点的确认及其糖型的准确鉴定。此外，ZenoTOF 7600 系统的Zeno阱富集功能，可以有效提高低含量糖肽的灵敏度，进而提高糖肽二级谱图的质量，确保糖基化分析的准确度。相比于完整蛋白水平的糖基化分析，糖肽水平的分析从新一维度上展现了蛋白药物的糖基化水平，二者可以相互验证和补充。

图4. rhEPO样品中N-糖肽AEN(24)ITTGCAE + (A4G3F1_OMe1)在CID(A) 和EAD(B)两种不同碎裂方式下的二级质谱图。b-离子/c-离子用蓝色线标识，y-离子/z-离子用红色线标识，B-离子/Y-离子用黄色线标识。

游离寡糖水平的糖基化分析首先通过使用特异性酶切（如PNGase F酶）的方式，将N-寡糖从糖蛋白上释放出来，将游离N-糖进行荧光标记（如2-AB、普鲁卡因胺等），再通过LC-MS分析。通过衍生化处理后，可以有效提高寡糖的离子化效率，结合ZenoTOF 7600 系统特有的Zeno阱富集技术，极大程度上提升了游离寡糖分析的灵敏度。通过 OS软件进行分析，可以获得多种寡糖类型的结构（如高甘露糖型、杂合型、复杂型、唾液酸化程度等）以及相对含量的信息，从而实现寡糖的鉴别与定量。推出的N-糖数据库，集成了CHO表达体系中常见的236种N糖，能覆盖常见单抗及多数融合蛋白的N糖种类，使用非常方便。下表展示了rhTPO中主要的N-寡糖种类及其含量，其中FA2G2糖型的占比最高（~23.7%）。通过游离寡糖的分析可以从整体上监测蛋白药物的糖型种类及含量，也是确保产品的质量、安全性和疗效的重要手段之一。

糖基化作为蛋白药物重要的翻译后修饰之一，对于蛋白药物的安全性和有效性至关重要，在蛋白药物的生产过程中需要采取适当的方法进行严格的监控。基于高分辨质谱系统的LC-MS方法是蛋白药物结构表征的必选方法，可以多维度充分满足蛋白药物糖基化的表征需求，包括完整蛋白水平、糖肽水平以及游离寡糖水平。通过对糖基化的深度分析，可以有效帮助生物药企业对蛋白药物的批间一致性，以及原研药和生物类似药的一致性进行分析。高分辨质谱ZenoTOF 7600 系统在蛋白药物糖基化分析中优势显著，主要体现在以下几个方面：