提升实验效率，加速科学发现

通过使用成像系统直接测量微液滴体积，并使用该系统对输入泵进行反馈控制，可以改善长时间形成的微液滴体积的单分散性。闭环反馈和快速响应的组合，无脉冲压力驱动泵送允许创建高度单分散的微液滴样品，而无需事先了解液体或系统的流体特性。在很短的时间尺度(秒)内，有反馈和没有反馈的压力泵系统的标准偏差是相似的，这表明液滴的单分散性在这些较短的时间内不会受到影响。在很长一段时间内，反馈系统纠正任何可能发生的漂移，压力泵系统产生的液滴平均体积比基于注射泵的系统噪音小。可以添加额外的反馈参数，进一步扩展对微滴生成的控制，如控制微滴生成的频率或被封装活细胞的浓度，以提供一个易于使用和直观的微滴生成系统。

微流控技术的微型化和实验室芯片系统的发展激发了人们对微流体学的兴趣。在这种技术中，微米尺度通道网络可以移动和操作液体。然而，通常情况下，这些通道由于高表面积体积比会与壁面产生强烈相互作用，导致意外分散和混合。通过将样品封装在第二种互不相溶的相中，在微流控网络中可以产生微滴。互不相溶载体相能够隔离每个独立的微滴并消除与壁面直接接触。这提供了一个强大平台，可生成适用于各种应用的独立反应容器，包括化学和生物化学反应、库生成及筛选以及纳米粒子制造等。此外，还可将单个颗粒、细胞或分子封装在微滴内进行单独研究，并实现单一水平上对其进行研究。该技术已被用于捕获单个DNA分子并进行聚合酶链反应（PCR）；同样地，在微滴内也可对单细胞测序进行。

这些实验能否成功进行取决于微滴的大小和单分散性，而微滴的大小和单分散性则受到流速、器件几何形状、粘度和界面张力等一系列参数的影响。通常情况下，可靠地生成已知大小的微滴往往需要经过多次试验。在许多微滴应用中，精确控制微滴体积至关重要，因为微滴体积变化会导致产品浓度估计出现误差；此外，在某些情况下如封装单个分子或细胞时，尺寸一致的微滴也显得非常重要。

微滴尺寸控制通常可分为主动和被动两类。在用于微滴尺寸主动控制的方法中，通常采用外部操纵来改变微滴大小，包括嵌入气动阀、电场、压电元件和光学加热等手段来控制微滴生成，然而这些技术需要先进设备或复杂外部设备。

被动微滴控制利用连续流动的互不相溶液体产生微滴。通过改变液体性质（如粘度或界面张力）、通道几何形状或简单调整流量，可以在广泛范围内改变微滴大小。微滴生成主要采用T形接头和流体聚焦接头两种配置。输入液体可使用注射器和压力泵进行控制。然而，注射器泵响应时间可能需要数秒甚至数分钟，限制了快速改变微滴大小的能力。基于压力的泵可以在不到一秒内迅速改变微滴生成大小，但每个入口所需压力取决于背压，而背压又依赖设备设计、管径长度及液体性质等因素，在实验条件下具有强烈依赖性，并可能导致实验过程中出现漂移。

为了应对这些问题，研发了一种压力泵反馈系统，该系统利用液滴形成的图像进行反馈和控制液滴大小。通过使用压力泵，可以快速触发变化，并且通过直接测量液滴大小来补偿任何漂移，从而以直观且易于使用的方式创建超单分散微液滴。之前的反馈系统采用注射泵，导致响应时间很长（数百秒）且多分散性很高。通过使用两个压力泵，压力变化（因此流速变化）将具有更快的响应速度，使闭环反馈系统能够在更高产量下运行。

含氟油（2% PicoSurf, Sphere Fluidics in Novec 7500）和去离子水分别使用四种不同规格的微流体驱动泵控制，流入到流动聚焦结构的PDMS液滴芯片中，样品储液池容量2mL，显微镜相机直接观察芯片中的“十”字的流动聚焦结构位置，以实时观察液滴小球的产生。
调整触发相机的阈值，以确保为每个液滴发送单个触发脉冲。根据以前的经验选择初始流量或压力，并在开始测量之前进行平衡。使用LabView (National Instruments)的视觉采集软件模块采集图像，并使用LabView的视觉开发模块进行实时处理。OB1压力泵的控制是使用制造商提供的驱动器实现的，可以在LabView中直接控制所需的压力。

四种规格的微流体驱动泵分别为基于步进电机驱动的注射泵（KD Scientific），无脉冲注射泵（Cetoni neMESYS），精密压力控制器（OB1 Elveflow，响应时间9ms，稳定时间40ms，允许在50ms内实现压力变化）两种工作模式：开环模式（仅在压力下驱动液体流动，没有闭环反馈）和闭环模式（基于图像识别的闭环模式，通过相机识别液滴的尺寸实现自动化的调节压力泵的输出压力，确保液滴直径保持一致。）
注射泵使用1mL的注射器，压力泵使用2mL的储液池。
每一种规格的系统至少测量15000个液滴小球。

图1：示意图显示了用于基于图像反馈的装置。两种不混溶液体(含氟油和水)通过由定制反馈软件控制的加压空气被泵入到具有流动聚焦结构的微流控芯片。利用红外激光器的后向散射信号，图像采集与液滴的存在同步。通过简单的图像处理，可以测量液滴的长度，计算体积，并将这些信息反馈给泵的控制。

图2：(a)液滴形成对所需液滴体积变化的响应。随着进水口压力的改变(紫色线)，所产生的每个液滴的体积(红点)迅速遵循所需的液滴轮廓(黑线)。(b)优化主导反馈参数Kp，使所需液滴体积从450到550 pL阶跃变化，显示低值时响应缓慢，大值时振荡。

图3：(a)使用恒定流量、步进电机驱动的注射泵(暗红色)、无脉冲注射泵(浅红色)、恒压泵(深绿色)和基于图像的反馈驱动的压力泵，在50赫兹(浅绿色)下产生液滴，在50分钟的时间尺度内产生归一化液滴体积。可以清楚地看到压力系统的单分散性的改善和反馈的漂移抵消效果。(b)在短时间尺度上的变化的详细视图，显示了由注射泵引起的振荡和由恒压泵引起的漂移。c)每种方法的归一化液滴体积的归一化直方图。

图4：注射泵(红色和粉色)、恒压泵(深绿色)和基于图像的反馈控制压力泵(浅绿色)在不同时间窗下的液滴大小分布变化。在短时间尺度上，两种基于压力的系统表现相同，但在长时间内，恒压系统的漂移变得明显，而基于图像的反馈保持不变。

图5：液滴反馈保持液滴体积(红点)在高液滴形成速率。逐步增加油压，并允许反馈系统优化水压力(紫色线)以形成300 pL的液滴。在较高的压力下，液滴体积误差的增加部分是由于快速移动的液滴产生的运动蓝。插图:低流速(左)和高流速(右)下的液滴图像，显示了运动模糊的增加。比例尺尺寸为50μm。

图7：反馈系统的扩展，以稳定微滴中平均细胞包封浓度。(a)细胞封装装置的显微照片，包括一个用于细胞悬浮样品的水入口，用稀释缓冲液稀释和流动聚焦，然后用不混相油流动聚焦以形成微滴。(b)使用注射泵时液滴体积(红色)和每液滴平均红细胞计数(黄色)的变化图。将细胞放在没有密度匹配的注射器中迅速沉淀，被包裹的细胞浓度迅速下降(黄色曲线)。通过将样品的密度与细胞相匹配，包封浓度有一个缓慢的漂移。(c)无反馈(时间< 0)和有反馈(时间> 0)的压力泵体积(绿色)和每滴细胞数(黄色)变化图。当使用压力泵时，也存在细胞计数的漂移，正如在时间= 0时开启反馈之前可以看到的那样，但是这可以通过反馈来改变稀释因子来补偿。(d)对密度匹配和非密度匹配的红细胞，在使用有反馈和无反馈的压力泵时，每滴细胞计数的提取变化率。该图显示了30分钟内每滴细胞计数的线性拟合的平均梯度，误差条为标准差(N = 3)。比例尺为300μm。

参考文献：
Crawford, D.F., Smith, C.A. & Whyte, G. Image-based closed-loop feedback for highly mono-dispersed microdroplet production. Sci Rep 7, 10545 (2017).

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