在真核生物中，基因编码区是不连续的，包含外显子和内含子两部分。外显子是基因中负责编码蛋白质的部分，相反，内含子是基因中不参与蛋白质编码的部分,它们存在于外显子之间，在转录过程中pre-mRNA中的内含子会被剪切掉，相邻外显子拼接形成最终成熟的RNA分子，这一过程被称为RNA剪接(RNA splicing)。

II型内含子（group II introns）是一类自我剪接内含子, 存在于真菌、细菌及古菌中, 在植物线粒体和叶绿体中也有发现，有研究推测原核细胞中的II型内含子随内共生事件整合到真核生物细胞器中。典型的II型内含子包含开放阅读框（ORFs）,编码特殊的成熟酶（maturase）蛋白，成熟酶可与II型内含子结合形成有催化活性的核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein，RNP），通过两步酯交换反应插入进行剪接。

图1. II型内含子RNA结构示意图

II组内含子核糖核蛋白是一种典型的剪接系统，与剪接体(splicesome)在结构进化和剪接机制上具有极大的相似性，真核生物的剪接体内含子可能起源于原核生物中的II型内含子，但人们对这一过程的结构性认识却一直很模糊。2023年11月22日，《Nature》杂志发表了来自美国耶鲁大学Anna Marie Pyle教授团队的关于这种古老的剪接系统机制最新成果， 标题为Structural insights into intron catalysis and dynamics during splicing。文章对核糖核蛋白及II型内含子在剪接过程中三种关键结构变化进行研究，并与真核生物的剪接体结构进行比较，发现剪接的关键反应分子和机制从古至今都十分类似。这些结构还揭示了分支螺旋的构象重排和剪接位点交换机制，这些发现揭示了剪接的进化过程中结构成分、催化机制和动态策略的高度保守。

图2. RNP剪接三个阶段结构

RNP剪接反应包含三个阶段状态：pre-branching (pre-1F),  pre-ligation (pre-2F) ，post-ligation (post-2F), 研究人员采用不同的策略分别孵育内含子RNA和maturase得到三种不同状态的RNP复合物进行冷冻电镜制样。由于传统的blot制样过程从加样到吸干到冷冻前后需要几秒钟，蛋白会产生严重的取向优势（preferred orientation），作者使用毫秒级冷冻制样设备chameleon进行冷冻电镜制样，在电镜下获得蛋白不同角度分布。

实验人员使用chameleon将40 nL蛋白溶液喷在载网上，无需滤纸吸附，直接插入到液态乙烷冷冻，整个过程仅仅400 ms, 如此短的制样时间可以避免在冻样时大部分蛋白吸附到气液界面（air-water-interface）而产生的取向优势问题。并最终分别得到pre-1F 2.9?，pre-2F 3.0?, post-2F 2.8? 的高分辨结构。

图3.  RNP三维重构颗粒角度分布热图

在本研究中，研究人员采用全自动冷冻制样设备chameleon，制备了三种状态下II型内含子RNA及成熟酶蛋白的冷冻复合物，并收集超过几万张冷冻电镜图片进行后续重构，最终重构颗粒角度分布十分全面，没有取向优势问题，最终整体分辨率在2.9埃左右，成功帮助研究人员揭示II型内含子剪切反应过程中动态变化，为理解蛋白转录过程及剪接反应的进化机制提供了清晰全面的冷冻电镜结构信息。

原文献:

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06746-6