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提取果蝇DNA的新实验教学方法

来源:广州贝拓科学技术有限公司      分类:前瞻 2024-03-01 18:45:04 139阅读次数
引言






果蝇是遗传学科研和教学中被普遍使用的生物,因为它具有染色体少、已定位基因数多,突变性状多的优点,因此,它是研究基因分离、连锁交换、基因表达与调节的理想材料。提取果蝇DNA并对其特定的基因片段扩增是多个实验项目中必要步骤,被广泛应用于各种基础性或开放性的遗传学实验课程。

提取DNA的质量直接影响后续PCR扩增、限制性酶切以及基因测序的实验效果。采用常规昆虫DNA的提取方法去提取果蝇的DNA不仅耗时长、成本高,而且提取的效果不稳定,不适合本科的实验教学。南开大学遗传学实验课程组将常用的动物组织DNA提取方法改造后用于实验教学,建立了一种高效地提取果蝇DNA的新方法,取得了良好的教学效果。


实验过程





材料:实验中采用的果蝇携带有YAP基因

提取方法:

(1)常规方法一:将两支果蝇麻醉后置于1.5ml EP管中;加入50uL含proteinase K(质量浓度20mg/mL)的Squishing Buffer(SB)缓冲液后用研磨棒将果蝇充分研磨,如沾壁可稍离心;置37℃金属浴孵育30min,转入95℃金属浴孵育2min;10000r/min离心3min,取上清液作为DNA模板。

(2)常规方法二:用剪刀将100uL移液器枪头的尖部剪去少许后,用移液器吸取50uL质量分数为5%的Chelex-100溶液(预先摇匀)到EP管中,另加入2uL的proteinase K(质量浓度20mg/mL);取两只麻醉后的果蝇于EP管中,用研磨棒充分研磨,涡旋振荡30s,于1000r/min离心1min混匀;将EP管置于56℃恒温水浴锅中水浴6h,再转入95℃水浴3min,14000r/min离心3min,取上清液作为DNA模板。

(3)高效法:去两只麻醉后的果蝇于1.5mL的EP管中,加入50uL NaOH碱裂解液(浓度100mmol/L,pH12),用研磨棒将果蝇充分研磨60s,使果蝇虫体全部碾碎;将EP管放入干式恒温中100℃孵育100min;之后加入50uL This-HCL(浓度40mmol/L)与原液充分混匀,经10000r/min离心2min,取上清液作为DNA模板。

DNA质量浓度及纯度检验:三种提取方法各设二次重复实验得到9份样品,分别取1uL DNA使用超微量分光光度计测定DNA质量浓度、A260/A280和A260/A230,比较三种方法提取的DNA质量浓度以及杂质情况。数据采用平均±标准差表示,并进行单因素方差分析,α=0.05。

PCR扩增:对提取的DNA的YAP序列进行PCR扩增。引物序列上游为TGAAACAGCAAGAACTGCTTC;下游为:CACCACTGCTCCCATTCA。PCR反应体系20uL,其中,含DNA模板0.4uL,上下游引物各0.4uL(10umol/L),ddH2O 8.8uL,Taq Master Mix 10uL。PCR扩增程序:95℃预变形3min;95℃变形15s,56℃退火15s,72℃延伸30s,30个循环;72℃再延伸2min,最后保持10℃。

PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测:取扩增后的9分PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,评价三种方法的基因组DNA的PCR扩增效率。样品量8uL,DNA Marker 3uL,核酸染料为GelRed 3uL,电压100V,电泳时间20min。通过凝胶成像仪成像。


实验结果





1、DNA质量浓度及纯度检测

统计DNA质量浓度、、A260/A280、A260/A230、提取时长以及成本数据(结果如下表)。高效法和常规方法一对比的话,提取量十分接近,但浓度更高,重复实验的方差小,提取效果也更好;高效法和常规方法二对比的话,常规方法二的DNA质量浓度低并且数据的方差大,提取效果很不稳定,和高效法相比差异明显。


提取方法

DNA质量浓度(ng/uL

A260/A280

A260/A230

提取时长(min)

实际成本(元)

常规方法一

673.5±44.45

1.28±0.13

0.58±0.13

19.17±1.04

3.5

常规方法二

359.9±98.25

1.29±0.11

0.56±0.04

371.5±1.5

0.13

高效法

676.5±28.74

1.61±0.01

0.44±0.005

15.17±0.76

0.02

表1 三种方法的实验数据


通过测定A260/A280判断样品中的蛋白质污染情况,纯度较高的DAN的A260/A280在1.6-1.8,低于此范围说明蛋白质含量超标,高于此范围表明样品中含有RNA。高效法提取样品的A260/A280约为1.6,表明DNA纯度较高,蛋白污染较小,且方差最小,重复性最好;另外两种方法提取的样品A260/A280均低于1.3,蛋白质含量超标,说明蛋白质被污染。

通过测定A260/A230值判断样品盐离子干扰情况情况,若A260/A230小于2.0,表明有小分子和盐类干扰。实验结果表现是,三种方法提取的盐离子都比较多。

图1 三种提取方法A260/A280和A260/A230的显著分析(ns表示无明显差异,**表示P<0.01)


2、PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测

对YAP基因片段进行PCR扩增,三种提取方法获得的DNA扩增产物的电泳条带都比较明亮且单一,在1000-1500bp(图3).三种提取方法获得的DNA样品都满足实验需求。

M:DNA Marker;1-3:常规方法一提取DNA扩增产物;4-6:常规方法二提取DNA扩增产物;7-9:高效法提取DNA扩增产物


图2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳


总结


本文选用的三种方法提取果蝇DNA的质量均满足实验要求,并且高效法提取的DNA浓度和纯度要比常规方法质量更高,方差更小。高效法对比常规的两种方法,不因操作步骤少,提取时间更短,并且成本也极低,提取果蝇的DNA效果明显,非常适合实验和教学需求。使用高效法,能为后续的实验设计奠定更好的基础,推动课程建设。

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最近更新:2023-09-18 16:20:36
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