2024年1月19日，由江南大学的许正宏教授和陆震鸣教授，以及牛津苏州先进研究中心的王允博士联合在《Microbial Biotechnology》期刊上发表了题为“Rapid detection of six Oceanobacillus species in Daqu starter using single-cell Raman spectroscopy combined with machine learning”的论文。该研究应用核心产品——P300共聚焦拉曼光谱仪结合机器学习检测了大曲发酵剂中的六种海洋芽胞杆菌（Oceanobacillus），评估了该方法在大曲发酵过程中快速检测功能微生物组成的潜在应用价值。

早在数千年前，我们的祖先就掌握了在谷物原料上培养功能微生物群落的技艺，即大曲的发酵生产。大曲作为糖化剂、发酵剂和生香剂，在白酒、食醋等传统酿造过程中具有重要作用，大曲中含有的复杂微生物组成能够极大影响产品风味品质。然而，由于原料种类、发酵环境的差异，即使是相同批次生产的大曲，在质量上也会存在一定的差异。因此，在发酵过程中对大曲功能微生物群落进行准确检测，是控制发酵批次稳定性和提升产品质量的重要方式。传统的培养方法虽然可以从大曲中分离出可培养的微生物菌种进行鉴定，但不适用于在发酵过程中功能微生物的快速检测。该研究结合单细胞拉曼光谱（SCRS）和机器学习技术，实现了对大曲发酵过程中功能微生物组成的无标记、无损、快速检测。

首先，对44份高温大曲进行了采样，并利用16s rRNA的V3-V4区进行扩增子测序，解析这些样品中大曲微生物的组成。根据测序结果，对大曲细菌群落中不同物种的Oceanobacillus进行纯培养分离，成功获得6个Oceanobacillus不同物种的代表菌株。接着，对这6株Oceanobacillus菌利用P300进行单细胞拉曼光谱检测，并利用5种模型进行分类训练，选择预测准确率最高的模型用于Oceanobacillus菌的分类。最后利用已知混合好的合成生物群落和未知的大曲微生物群落进行单细胞拉曼光谱采集和模型预测验证。

本研究，利用16S rRNA基因扩增子测序对大曲细菌群落中的Oceanobacillus进行了物种水平的多样性分析，发现其主要分布于6个Oceanobacillus物种（O. caeni, O. kimchii，O. iheyensis，O. sojae，O. oncorhynchi subsp. Oncorhynchi和O. profundus)。随后根据测序结果，对6种Oceanobacillus进行纯培养分离和物种鉴定。将不同种类的Oceanobacillus的分类信息与它们的单细胞拉曼光谱相关联，从而构建了大曲Oceanobacillus的参考数据库。

图3 6种Oceanobacillus单细胞拉曼光谱的化学计量分析

A：O. proundus典型细胞形态的光学显微照片；B：属于6种Oceanobacillus的200个单细胞的平均拉曼光谱；C：6种Oceanobacillus拉曼光谱的LDA可视化；D：6种Oceanobacillus拉曼光谱平均值的HCA结果。

在识别Oceanobacillus拉曼数据集的五种机器学习算法中，支持向量机表现最优。通过对含有不同比例Oceanobacillus合成微生物群落的检测，验证了基于支持向量机分类模型的适用性，预测结果与期望值的平均绝对误差小于1%。进一步对不同发酵时间大曲样品中的Oceanobacillus相对丰度进行检测，结果表明拉曼结合支持向量机预测结果与扩增子测序检测结果之间呈正相关线性关系。

图8 基于拉曼光谱和16S rRNA测序的Oceanobacillus群落丰度比较。

(A)拉曼光谱结合支持向量机和扩增子测序对高温大曲发酵过程中Oceanobacillus的种水平检测；(B)利用PLS-R模型拟合大曲发酵过程中Oceanobacillus的SCRS与16S rRNA基因测序的线性回归模型。

本文通过单细胞拉曼光谱结合机器学习的方法，开发了一种可以快速检测大曲发酵剂中6种Oceanobacillus菌种的方法。该方法具有快速、非破坏性和无标记的特点，可以在较短时间内完成大曲样品的检测过程，为大曲发酵过程中微生物组成的监测提供了新的有效途径。该方法在大曲发酵剂的质量控制和过程监测过程中应用可以提高发酵过程的效率和稳定性，对于酿造业具有重要的应用价值。

原文链接：

https://doi.org/10.1111/1751-7915.14416