应用呈递丨使用 Clarity OTX 固相萃取 (SPE) 从组织中提取 2′-MOE 硫代磷酸酯-医疗器械网

应用呈递丨使用 Clarity OTX 固相萃取 (SPE) 从组织中提取 2′-MOE 硫代磷酸酯

来源：天津博纳艾杰尔科技有限公司分类：促销 2024-04-19 17:15:13 101阅读次数

概述

寡核苷酸带来了一种新兴的治疗方式。因为它们可以调节基因表达以及内含子和外显子的转录后剪接，所以寡核苷酸可以用于治疗各种适应症，甚至可以针对在过去不可成药的靶点。然而，与寡核苷酸相关的挑战有很多。对于参与生物分析工作流程的分析化学家来说，挑战是多方面的。生物分析工作流程高度依赖于样品制备，特别是寡核苷酸的提取，对于能够达成优秀的分析特异性、灵敏度和线性来说是必不可少的。

由于治疗性寡核苷酸因其对核酸酶抗性的大量修饰而具有独特的理化性质，因此蛋白质沉淀或其他传统的样品制备方法具有很大的挑战性。此外，由于它们的剂量相对较低(有时低于1mg/kg)，因此为寡核苷酸药代动力学测定获得相关的定量下限(LLOQ)和良好的线性尤其具有挑战性。

一种常用的方法是使用新型的单步固相萃取方案(SPE) Clarity OTX。本文展示了从中枢神经系统(CNS)组织中提取2'-甲氧基乙基(MOE)硫代磷酸酯剪接转换寡核苷酸(SSO)。

材料和方法

所有样品和分析物(全硫代，2'-MOE间隔核苷酸和内标)均购自Inte-grated DNA Technologies (Coralville, IA)。所有实验均由第三方签约实验室进行。使用Shimadzu Nexera HPLC和SCIEX Triple Quad 6500+标称质谱仪进行分析。数据处理在SCIEX Analyst软件上进行。LC和MS条件分别见表1和表2。

样品制备

如前所述，样品预处理后进行样品制备。按照供应商的建议，使用Clarity OTX固相萃取试剂盒(96孔板，100mg/孔规格)进行固相萃取。

样品预处理

在匀化缓冲液中加入250μg/mL蛋白酶K。

2.5% IGEPAL, 5mM EDTA, 50mM Tris pH=8.0, 250μg/mL蛋白酶K, 4:1 (v:w)

在每根试管中加入陶瓷珠。

使用Geno Grinde或类似设备在1700rpm速度下离心振荡2分钟

在55℃的水浴中孵育1小时

将匀浆储存在-70℃环境中以备用

萃取方案

将75μL校准标准品、QC样品、研究样品分别放入2mL 96孔圆底板 (PHX货号：AH0-8636)

96孔板：Clarity OTX 100mg/孔

货号：8E-S103-EGA

活化：1mL MeOH

平衡：1mL平衡缓冲液 (50mM乙酸铵, pH 5.5)

添加：600μL裂解加载缓冲液到所有样品中

上样：离心振荡约5分钟后加载预处理样品；在RT下再培育5分钟

转移：溶液到TOMTEC或类似设备

淋洗1：3x1mL平衡缓冲液

淋洗2：3x洗涤缓冲液 (50mM醋酸铵, pH 5.5: ACN, 50:50)

洗脱：0.5mL洗脱缓冲液 (100mM碳酸氢铵, pH 9.5:ACN:THF (50:40:10, v/v/v))到收集板

干燥：在温和的氮气流下干燥至约400μL

在分析之前，离心振荡混合样品约1分钟。

QC样品和内标的总离子色谱图

ASO寡核苷酸在1.5，30和300ng下的QC样品和内标(IST)的总离子色谱图(TIC)。IST获得一致的峰面积，表明每个标准品都有良好的回收。

HPLC条件

色谱柱：Biozen 2.6μm Oligo

规格：100x2.1mm

货号：00D-4790-AN

流动相：

A: 1.0%HFIP, 0.1%DIPEA水溶液, 含10μm EDTA

B: 0.075%HFIP, 0.0375%DIPEA乙腈水溶液(35:65), 含10μm EDTA。

梯度：

梯度斜率: 20-60%B, 1.5分钟内

柱洗: 20-95%B (2x)

流速：0.5mL/min

进样量：2μL

温度：80℃

MS条件

极性条件：(-)

CAS气体：10

气帘气：20

GS1(psi)：50

GS2(psi)：50

喷雾电压：-4000V

温度：500℃

MS条件

中枢神经系统组织(脑和脊髓)标准曲线和QC样品综述

结果与讨论

从各种生物基质中提取寡核苷酸具有挑战性，可能导致低回收率的原因之一是样品预处理，即在均质化和固相萃取之前的组织制备。过去报告中的样品预处理步骤1、2利用的是蛋白酶K，这是一种非特异性丝氨酸蛋白酶，通常用于需要细胞或组织样品均质化的分子生物学应用。独特的是，蛋白酶K在变性条件下得到的结果更好，因此在消化过程中使用非离子洗涤剂至关重要。组织粉碎也遵循文献建议进行，采用基于陶瓷珠的均质化。

在消化和粉碎之后，组织匀浆将更适合于固相萃取，可以像任何其他非固体基质一样进行处理，如血清或血浆。用加标脑组织生成的标准曲线表明，准确度和回收率均高于可接受的水平，所有标准品和重复品的%CV均小于11%。脊髓和大脑的QC样品的结果也很好，具有可接受的低、中、高CV和准确度，如表4所示。内标也获得了一致的峰面积，如图1所示。

总结

由于寡核苷酸结构的复杂性和理化性质，将其从生物基质（特别是固体组织）中提取和清理出来具有独特的挑战。

为了确保从组织中提取寡核苷酸时的回收率和可重现性，必须使用有效的样品预处理策略。这包括用蛋白酶K消化和组织粉碎。匀浆之后就可以像任何其他样品基质一样进行处理，比如直接使用Clarity OTX固相萃取平台进行寡核苷酸的提取。可能还需要对SPE本身进行优化，具体取决于分析物和基质的干扰。

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