功能菌株筛选全流程解决方案丨低丰度功能菌富集篇-医疗器械网

功能菌株筛选全流程解决方案丨低丰度功能菌富集篇

来源：长春长光辰英生物科学仪器有限公司分类：动态 2023-10-23 15:41:35 92阅读次数

前言

众所周知，环境中的低丰度微生物尽管在数量上较少，但它们对于维持环境平衡和生态系统功能的贡献不容忽视。例如，参与到生态系统的底层过程中（如有机物的降解、养分循环等）；作为特定生态系统中的特异性生物标志物；携带着特定功能基因，作为潜在基因库；具有较高的适应性和抗逆性；作为特定的生态过程（如氮循环、硫循环、甲烷产生）的关键参与者；具有对有毒物质进行降解或修复的潜在功能等等。

图1 （低丰度）微生物具有重要的生态功能及应用价值

对低丰度菌的研究有助于扩展我们对微生物世界的认知，从而促进对微生物资源的开发利用以及生态环境保护与治理等。然而，由于在群落中占比非常小且生长不占优势，低丰度微生物在分纯培养中很容易丢失；而宏基因组学的检测限一般在0.1-1%左右，这使得大量低丰度目标菌的生态生理学研究仍十分困难。

目前用于微生物富集的方法包括过滤法、离心法、微生物聚集体捕获法、电化学富集法、流式细胞术、选择性培养法等（图2），但是这些方法通常用于低生物量样品中微生物的整体富集（如使用过滤法、离心法、聚集体捕获法等富集水体中的微生物），或者已知表型信息的特定类群微生物的富集（如电化学法富集电活性微生物，流式法富集某些可荧光标记的微生物），均无法以低丰度功能性微生物为目标进行免标记的富集，通用性不强。而选择性培养法虽然可以依赖功能性对低丰度功能菌进行富集，但生长过于缓慢的低丰度菌仍很可能在培养过程中丢失。

图2 现有微生物富集方法均无法针对低丰度功能类群进行富集

可见，从复杂的环境微生物群落中定位到低丰度的功能微生物存在巨大挑战，磁性纳米颗粒介导的分离技术(magnetic nanoparticle-mediated isolation, MMI)是近年发展的能从复杂菌群中分离活性功能微生物的有效方法，在低丰度菌富集方面具有通用性的应用价值。

技术原理

MMI是一种新的方法，可以在不标记的情况下分离微生物群落中快速生长和缓慢生长的种群。MMI通过生物相容性磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)对群落中微生物进行非特异性磁化，即磁化样品中的所有微生物细胞。随后在适宜的底物和环境下对样品进行培养，其中具有代谢活性的微生物会随着细胞的持续分裂和增殖而丢失其表面的MNPs，直至失去磁性；而分裂不活跃的微生物（通常为低丰度菌群）表面的MNPs会始终保持磁性。最后，通过外部磁场的作用将分裂的细菌与保持磁性的非分裂细菌分离开，分别获得高丰度与低丰度的类群（图3）。

图3 MMI富集原理及流程图

MMI富集获得的低丰度微生物仍是群体状态，为深入研究其功能性，MMI可以与稳定同位素探针技术（Stable isotope probe, SIP）相结合，从复杂的环境样品中检测低丰度的功能微生物单细胞，例如，13C标记底物可识别降解菌，1?N标记底物可识别固氮菌，在抗生素、高温、酸性等选择性压力环境下使用D?O孵育可识别耐药菌或极端耐受菌。这些功能菌株可进一步应用自主开发的PRECI SCS可视化单细胞分选仪将功能菌分离出来，进行培养、单细胞测序或多组学研究，建立微生物的功能表型与基因型的关联关系，从而更好地实现微生物资源的开发利用。

图4 应用PRECI SCS可视化单细胞分选仪分离获取功能菌株

Protocol

磁性纳米颗粒制备

1 M FeCl? 1 mL与2 M的FeCl? 2 mL充分混匀；
2 M NaOH溶液25 mL缓慢逐滴加入到上述溶液中，涡旋搅拌30 min，形成黑色的氧化铁沉淀；
用永磁铁收集合成的上述磁性纳米颗粒（MNPs），无菌水清洗约5-7次，直至溶液pH=7；
取5 mL MNPs与45 mL 10mg/mL丙烯胺盐酸盐（一种阳离子聚电解质，使MNPs带正电）混合；
75 W，40 KHz超声60 min，使MNPs稳定；
10000 g 离心10 min，重悬于50 mL去离子水中，涡旋混匀；
使用0.2 mm滤器过滤，保存待用。

低丰度微生物富集

土壤等环境样品溶于10mL水中，充分震荡提取细菌，3000rpm离心10 min去样品杂质，收取上清样品；
10 ml样品与10 mL MNPs溶液混合；
细菌-MNP混合物室温下150rpm震荡20min；
使用永磁体将细菌-MNP从水中分离提取出来，重悬于去离子水中，反复洗涤3次；
将细菌-MNP重悬于10 mL培养基中或者过滤消毒的原环境培养基中；
培养过程中，MNPs被逐渐稀释，进而消失磁性，同时达到富集细胞的作用。

应用案例

基于MMI-SIP-RACS技术的菲降解菌筛选研究

磁性纳米颗粒介导分离-稳定同位素探针技术 (MMI-SIP) 是一种不依赖于培养、具有高分辨率的功能微生物识别技术。但该技术主要在群落水平上进行目标类群富集与探测，无法从单细胞水平直接将微生物与其表型和生态功能相联系。本研究以13C-菲为目标化合物，建立了一种MMI-SIP与可视化单细胞精准分选技术相结合的新方法（即MMI-SIP-RACS），对多环芳烃 (PAH) 污染水体中降解菲的活性细菌进行探查（图5）。

图5 基于MMI-SIP-RACS技术的降解菌筛选流程图

结果显示，MMI-SIP-RACS能够显著富集菲降解菌（图6），并应用PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪成功分离出具有代表性的菲降解功能微生物单细胞（图7）。PRECI SCS-R300基于激光诱导向前转移（Laser induced forward transfer, LIFT）原理，具有独特的可视化分选功能，能够所见即所得地获得目标菌（图8）。综合SIP扩增子测序、拉曼光谱中单细胞的13C移位以及单细胞测序的结果，证实新鞘脂菌属(Novosphingobium) 是降解菲的活性菌。此外，MMI-SIP-RACS重构了Novosphingobium的菲代谢途径，识别出了相关的功能基因，包括两个编码菲双加氧酶和萘双加氧酶的新基因。

图6 经过MMI-SIP富集后，目标菌丰度从原始样品（T0）的0.03%提高至10.9%

图7 菲降解菌的单细胞拉曼识别（13C峰位偏移）及可视化分选（应用PRECI SCS-R300拉曼单细胞分选仪）

图8 PRECI SCS-R300的单细胞识别与自动化分选过程

综上所述，MMI-SIP-RACS是一种能够精确地从复杂微生物群落中分离活性PAHs降解菌的有效方法，可在单细胞水平上直接将微生物与其功能和基因型联系起来，对有机污染物的原位生物降解机理提供新的认识。

Q & A

Q：MMI方法是微生物通用型标记还是特异性标记？

A：MMI方法是一种通用标记方法，利用磁性纳米颗粒表面聚合物结合所有类型细胞，包括细菌、真菌等。不同类型细胞差异略有差别，但是不影响后续磁性分离分离功能微生物的效率。

Q：MMI方法对于微生物的标记是普适性的结合吗？有没有不同种间的捕获率差异？

A：MMI技术对微生物的标记是通用性结合。磁性纳米材料表面修饰了一层多聚物外壳，可以跟所有微生物进行高效结合。当然这种方法对不同微生物细胞的结合效率是有差异的，比如对革兰氏阴性菌的结合效率比革兰氏阳性菌好一些，对微生物细胞比对哺乳动物细胞好一些，但是这种差异是百分比数量级，比如5-20%的差异。这种差异对研究微生物活性的影响很小，经测试具有活性的微生物在分裂后磁性只有原来的1%-1‰，所以这种标记差异对高活性及低活性微生物分离的影响不大。此外，也可通过对磁性纳米颗粒的修饰，实现对特定种类微生物的捕获与富集分离。

Q：对于复杂环境样本如土壤，MMI方法可以适用吗？

A：MMI方法非常适用于土壤样本，相关文献包括[1]Jiang, B., Chen, Y., Xing, Y., Lian, L., Shen, Y., Zhang, B., Zhang, H., Sun, G., Li, J., Wang, X. and Zhang, D., Negative correlations between cultivable and active-yet-uncultivable pyrene degraders explain the postponed bioaugmentation, Journal of Hazardous Materials, 2022, 423, 127189. [2]Wang, X., Zhao, X., Li, H., Jia, J., Liu, Y., Ejenavi, O.E., Ding, A., Sun, Y. and Zhang, D., Separating and characterizing the active and functional alkane degraders from crude oil contaminated sites via magnetic nanoparticle-mediated isolation (MMI), Research in Microbiology, 2016, 167, 731-744. [3]Jiang, B., Lian, L., Xing, Y.*, Zhang, N., Chen, Y., Lu, P. and Zhang, D.*, Advances of magnetic nanoparticles in environmental application: Environmental remediation and (bio)sensors as case studies, Environmental Science and Pollution Research, 2018, 25(31), 30863-30879。

Q：MMI技术富集微生物，会影响后续拉曼检测的信号吗？

A：根据MMI的原理，我们知道所富集获得的微生物其表面的磁性纳米颗粒基本上都脱落了，不具备磁性。根据既往实验结果，它们和其他细胞一样，不会影响后续的拉曼检测。另外，如果需要分离特定功能的微生物细胞，还需要进行稳定同位素标记，然后再进行拉曼检测。

Q：MMI技术有什么短板吗？

A：目前最大的短板是不可避免在一定程度上改变研究对象的微环境。首先，给微生物包覆一层物质会非常细微的影响微生物的代谢；其次，在这个过程中会引入一些原始环境中没有的元素，可能对微生物群落代谢造成影响，比如磁性纳米颗粒中的铁元素，可能会对环境介质中的铁流循环或者电子传递非常敏感的过程产生影响。电子可能会随着磁性纳米颗粒来转导而不遵循原有的代谢途径，导致对某些特定的过程（如反硝化和铁流循环）产生一定影响。这种微环境或电子传递环境的变化可能会导致分析结果存在一定偏差，这也是科学家们正在解决的问题。

Q：磁性标记物如何控制单个细胞的分选？

A：MMI技术的磁性标记不是用于单个细胞的分选，而是将原有微生物群落中1/1000到1/10000的功能微生物通过磁性变化进行群体富集，使之在分离后的丰度达到5-50%，便于提高后续单细胞分选的效率和速度。使用MMI方法将低丰度菌富集后，可进一步使用PRECI SCS微生物单细胞分选仪进行单细胞的可视化分离。

参考文献

[1] Jibing Li, Dayi Zhang, Bei Li, Chunling Luo,* and Gan Zhang, Identifying the Active Phenanthrene Degraders and Characterizing Their Metabolic Activities at the Single-Cell Level by the Combination of Magnetic-Nanoparticle-Mediated Isolation, Stable Isotope Probing, and Raman-Activated Cell Sorting (MMI?SIP?RACS), Environmental Science & Technology, 2022 Feb 15;56(4):2289-2299.
[2] Nan Rong, Shiying He, Bei Li, Xiangui Lin, Xiaoling Liu, Yongjie Yu, Youzhi Feng, Coupled magnetic nanoparticle-mediated isolation and single-cell image recognition to detect Bacillus’ body size in soil, European Journal of Soil Science, 2022;73:e13236.

[3] Jibing Li, Chunling Luo, Gan Zhang,
Dayi Zhang, Coupling magnetic-nanoparticle mediated isolation (MMI) and stable isotope probing (SIP) for identifying and isolating the active microbes
involved in phenanthrene degradation in wastewater with higher resolution and accuracy, Water Research, 2018 Nov 1:144:226-234.

[4]Jiang, B., Chen, Y., Xing, Y., Lian, L., Shen, Y., Zhang,B., Zhang, H., Sun, G., Li, J., Wang, X. and Zhang, D., Negative correlations between cultivable and active-yet-uncultivable pyrene degraders explain the
postponed bioaugmentation, Journal of Hazardous Materials, 2022, 423, 127189.

[5]Wang, X., Zhao, X., Li, H., Jia, J., Liu, Y., Ejenavi, O.E.,
Ding, A., Sun, Y. and Zhang, D., Separating and characterizing the active and
functional alkane degraders from crude oil contaminated sites via magnetic
nanoparticle-mediated isolation (MMI), Research in Microbiology, 2016, 167,
731-744.

[6]Jiang, B., Lian, L., Xing, Y.*, Zhang, N., Chen, Y., Lu, P.and Zhang, D.*, Advances of magnetic nanoparticles in environmental application: Environmental remediation and (bio)sensors as case studies,
Environmental Science and Pollution Research, 2018, 25(31), 30863-30879。

[7] Dayi Zhang, James P Berry, Di Zhu, YunWang, Yin Chen, Bo Jiang, Shi Huang, Harry Langford, Guanghe Li, Paul A Davison, Jian Xu, Eric Aries, Wei E Huang, Magnetic nanoparticle-mediated isolation of functional bacteria in a complex microbial community, The ISME Journal,2015 Mar;9(3):603-14.

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