提升实验效率，加速科学发现

在基于水凝胶的多孔介质中进行细胞微囊化是一种在再生细胞治疗中已经取得巨大成功的方法。这些微胶囊通过将外源性细胞和材料隐藏在一种坚固的生物材料中来防止它们被免疫系统识别。大量的配方和添加剂正在不断地被测试，以优化水凝胶的细胞活力和机械性能。确定新的微胶囊添加剂的效果是一个漫长的过程，通常需要大量的体外和体内测试。在本文中，我们开发了一种使用纳米压痕(即在原子力显微镜中用纳米探针压痕)和定制微流体收缩装置的工作流程，以表征氧化石墨烯(GO)对三种微胶囊配方的影响。通过我们的工作流程，我们确定了GO以一种配方依赖性的方式改变了微胶囊的硬度和表面性能。我们的结果还首次表明，GO改变了微胶囊水凝胶的构象及其与后续涂层的相互作用。总之，我们的工作流程可以推断新添加剂对微胶囊表面的影响。因此，我们的工作流程可以帮助减少新微胶囊配方验证所需的时间，并加速其临床转化。

在过去的几十年里，再生细胞疗法在治疗许多疾病方面取得了令人鼓舞的成功，使用的方法包括细胞封装。细胞封装旨在将细胞固定在一个基于水凝胶的多孔微球或大球中，允许营养物质在内部扩散，治疗产品(如胰岛素和促红细胞生成素)在外部分泌，同时避免免疫系统的监视。细胞封装的有效性取决于外源性细胞和材料的成功隐藏，这需要足够的机械阻力来防止微胶囊破裂和随后的内容物释放。目前，微囊化细胞疗法的主要挑战包括微胶囊内部的死亡细胞积累和优化从被封装的细胞中持续释放产品以实现长期治疗。为了克服这些挑战，经典微胶囊配方中添加了添加剂或涂层，从而改变了微胶囊的特性(即杂交微胶囊)。具体而言，氧化石墨烯(GO)和微胶囊技术的结合已被证明可以改善海藻酸盐胶囊中的长期细胞存活和可持续的治疗性蛋白质释放，而不会引发异物反应。
 
GO被广泛应用于生物应用领域(如药物输送、组织工程和生物传感)。GO作为一种添加剂之所以受到欢迎，其原因之一是其优异的机械性能。具体而言，GO已被证明可以提高多孔生物材料的抗拉强度，而不会改变其孔径或厚度，这对于保持营养物质进入胶囊的扩散性和保持胶囊中细胞的存活至关重要。有趣的是，低浓度的GO已被报道可以提高胶囊中细胞的存活率。虽然将GO纳入新的微胶囊配方可能对细胞存活有利，但关于GO对海藻酸盐水凝胶结构和由此产生的机械性能的潜在影响仍存在疑问。新添加剂的作用对微胶囊表面尤为重要，宿主细胞与微胶囊材料之间的相互作用就发生在微胶囊表面。如前所述，微胶囊最外层的不稳定界面可能对性能和生物相容性产生深远的影响。因此，为了在体内测试之前精制配方并更快地推进再生细胞疗法，开发技术来表征新设计的微胶囊配方的机械和表面特性至关重要。

以前的研究使用傅里叶变换衰减总反射(ATR-FTIR)红外分光光度法来表征杂交微胶囊成分对表面聚合物构象的影响。然而，这种技术只能在微胶囊的小深度(100 A)内提供洞察力，并且仍然难以解释。扫描电子显微镜(SEM)是一种有价值的表征表面的技术。然而，大多数SEM样品制备程序会改变水凝胶结构，从而提供不准确的表面表征。相反，原子力显微镜(AFM)是一组强大的表征材料表面性能的技术，它不依赖于样品的改性。最近，少量研究使用AFM表征液体生理环境下的微胶囊表面。AFM的纳米分辨率可以提供微胶囊表面形貌的准确数据以及表面水平的局部刚度测量。在以前的研究中，我们使用AFM来表征微胶囊表面的结构。一种流行而强大的AFM技术，用于同时获取微胶囊的形貌和刚度图，称为基于力谱成像(FSBI)。自2000年前以来，Hinderdorfer等人已经使用了这种技术的变体，以产生抗体-抗原识别力的定量非形貌图像，以及其他分子相互作用和物理特性。在我们之前的论文中，我们首次利用FSBI和刚度-形貌共定位分析来研究微胶囊添加剂对聚合物构象的影响。这种技术的组合为我们提供了关于微胶囊表面特性的有用信息，但仅此还不足以确定微胶囊的整体刚度。此外，通过纳米压痕测定的刚度仅对小应变有用，而水凝胶微胶囊往往受到大应变。

由于在注射过程中被迫穿过一根刚性针头，微胶囊会受到高剪切应力和相当大的应变。过大的剪切应力可能导致微胶囊破裂，从而释放其内容物，这可能会引发免疫反应。虽然AFM是表征表面形貌和表面刚度的一种敏感技术，但评估整体刚度需要一种不同的方法，特别是对于注射过程中施加的大应变。通过微操作、抽吸或收缩进行的剪切应力应用分析已被用于研究微胶囊的整体刚度。由于材料的非弹性行为和球形几何形状引起的不均匀压缩，大变形的刚度实验测定不是微不足道的。然而，收缩测试(即强迫胶囊通过狭窄通道)可以用来近似压力/变形关系，以比较不同的微胶囊成分，作为基于FSBI的表面形貌和刚度的补充测量。

在此，我们使用两种互补的方法来表征杂交微胶囊配方。首先，我们使用FSBI来分析GO对三种不同海藻酸盐微胶囊表面特征和机械性能的影响。特别是，我们测试了GO对海藻酸盐微胶囊(A)、具有双聚L-赖氨酸(PLL)?海藻酸盐涂层的海藻酸盐微胶囊(海藻酸盐?PLL?海藻酸盐，APA)和液化APA微胶囊(即用柠檬酸钠处理以产生更软的胶囊)的影响。使用FSBI，我们表征了微胶囊表面的形貌和表面水平的硬度。同时，我们还开发了一种定制的收缩测试来执行微胶囊的整体硬度测量。最后，我们建立了形貌和表面硬度之间的相关性，以确定GO对微胶囊表面和聚合物构象的影响。我们的结果表明，GO的影响取决于微胶囊配方。特别是，我们的结果表明，氧化石墨烯改变了刚度-地形分布，从而表明氧化石墨烯改变了海藻酸盐水凝胶的构象，以及涂层与海藻酸盐的结合。由这两种技术(FBSI和微胶囊缩小)组成的工作流程可用于体外评估杂交微胶囊配方的机械性能。我们预计这两种技术的结合将有助于加快微胶囊配方的开发，并最终在临床应用中使用。

图1. FSBI方法的示意图。(A)微胶囊固定在尼龙网内，通过AFM获得(B)基于光谱的测量。(C,D)为每个微胶囊获得基于力谱的网格，并进行处理，以获得(C)相同微胶囊表面积的地形图和(D)刚度图。(E)表示地形图图像二维统计量的特征的示意图。(F)生成地形图和刚度图的叠加，以确定这两个参数的共定位程度。(G)通过FSBI获得的刚度测量与通过定制的微流体系统收缩实验获得的宏观测量进行比较。

图2. 三种不同微胶囊配方及其添加氧化石墨烯的示意图，以及通过FSBI获得的代表性微胶囊的形貌图像。海藻酸微胶囊通过在静电雾化发生器中挤出海藻酸溶液来生产。这些微胶囊首先用聚L-赖氨酸涂层处理，然后用海藻酸涂层处理，以生产APA微胶囊。APAliq微胶囊通过在柠檬酸钠溶液中孵育APA微胶囊来获得。为了获得它们的添加氧化石墨烯的配方，初始海藻酸溶液中添加100 μg/mL GO。每个微胶囊的形貌图像(9 μm2)被获取，以分析不同微胶囊组成导致的形貌差异。高度比例条被调整，以优化形貌细节的可视化。

图3.微胶囊表面的拓扑学研究。从微胶囊的拓扑图(9 μm2)计算的标准拓扑参数。(A,B)显示粗糙度参数的图表：(A)Ra和(B)RMS，(C)示例线轮廓上Ra和RMS显著性的示意图。(D,E)显示图像高度参数的图表。(D)最大图像高度，(E)中位图像高度，(F)示例线轮廓上最大和中位图像高度的示意图。(G)显示图像中高度分布的测量值的偏斜度图表。(H,I)示例线轮廓上(H)高偏斜度和(I)低偏斜度的示意图。每个微胶囊成分N≤5个样本。图表显示均值± SEM。双向方差分析显示GO效应和微胶囊配方效应对粗糙度和高度分布的独立性，而这些效应对高度参数的相互依赖性。Sidak的多重比较检验用于比较GO与对照胶囊以及每个配方与A。* = GO与对照胶囊的显著性。# = 与A微胶囊相比的显著性。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

图4. FSBI获得的代表性微胶囊刚度图。(A) 获取每个微胶囊的地形图和杨氏模量分布图(9 μm2)，以建立微胶囊组分之间的地形-刚度共定位差异。海藻酸盐和A GO胶囊的样本图像被描绘，包括地形图和刚度图以及覆盖图(绿色=刚度，红色=地形，黄色=共定位结构)。(B-D) 使用van Steensel方法计算所有胶囊的皮尔逊相关系数。每个添加GO的微胶囊配方与其对照配方进行比较。(B) A vs A GO的皮尔逊相关系数比较，(C) APA vs APA GO，以及(D) APAliq versus APAliq GO微胶囊。(E) 所有微胶囊配方的示意图，配方分配了颜色代码。(F) 配方之间的共定位程度以x=0时的皮尔逊系数表示，来自图(B-D)。通过单因素方差分析和事后图基检验计算每对比较配方之间的显著差异。*= GO vs对照微胶囊的显著性。§ = 与0相比的显著性。**p < 0.01；***p < 0.001。

图5. 微胶囊收缩实验。(A) 收缩系统设置的图形描述。(B) 收缩实验过程的方案和计算弹性常数所需的参数：每个微胶囊的初始直径(标记为D)和穿透长度(标记为L)被光学测量。同时，压力控制器设置入口的压力(标记为P)(C) 微胶囊收缩实验的显微镜图像(徕卡)。为可视化目的，微胶囊的苏木精染色。

参考文献：
Virumbrales-Mu?oz M, Paz-Artigas L, Ciriza J, Alcaine C, Espona-Noguera A, Doblaré M, Sáenz Del Burgo L, Ziani K, Pedraz JL, Fernández L, Ochoa I. Force Spectroscopy Imaging and Constriction Assays Reveal the Effects of Graphene Oxide on the Mechanical Properties of Alginate Microcapsules. ACS Biomater Sci Eng. 2021 Jan 11;7(1):242-253.

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