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如何优化和监测微藻细胞培养

来源：贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司分类：动态 2023-10-30 16:28:35 60阅读次数

微藻是由广泛分布在环境中约30,000种光合作用真核微生物组成的一个多样化的分类群。¹由于微藻可产生高生物量和高价值化合物，在多种商业应用中极具开发潜力，如环境科学、生物燃料、制药、化妆品、水产养殖、人类食品和动物饲料等应用领域。^2,3为了最大限度优化藻类产量，确定其最佳生长条件至关重要。

本案例将展示如何使用搭载光照LAM模块的BioLector XT微型生物反应器以及Multisizer 4e库尔特计数器，优化微藻细胞培养条件并表征细胞生长。

图1.采用BioLector XT微型生物反应器和Multisizer 4e库尔特计数器，监测藻类细胞培养。

在线监测培养参数

BioLector微型生物反应器适用于高通量筛选、培养参数监测（如pH、生物量、溶氧值、振摇速度、荧光强度）以及补料策略优化等。能够在连续的振摇及补料控制下实时在线监测所有参数。

在本示例中，我们采用BioLector微型生物反应器确定培养体系的补料策略。以及搭配仪器搭载精密光照模块（LAM）BioLector XT微型生物反应器，用于微藻小球藻（Chlorella vulgaris）的光合自养培养。

细胞培养结果

图2为长时间培养过程中散射光（生物量）、叶绿素荧光和pH的在线测量结果。如图所示，为期16天的培养监测中，生物量浓度（显示为灰线）持续增加，直至CO₂供应被关闭。图中可观察到五个不同的生长阶段：首先是滞后和指数生长期（I.），之后是三个不同速度的线性生长期（II.至IV.），最后是CO₂耗尽后进入的死亡阶段（V.）。pH和叶绿素信号（分别显示为红线和绿线）的变化过程与观察到的生长阶段相关。

在整个实验过程中，散射光信号的平均变异系数为5.2%，变异系数较低，表明BioLector中的设置适用于并行光营养培养。

图2.搭载LAM模块的BioLector XT微型生物反应器，为期16天的培养中监测的散射光、叶绿素和pH。

上述实验结果证实，BioLector XT微型生物反应器适用于微藻的长期培养与监测。在测量过程中连续振摇，可确保悬浮细胞的持续传质和均质。并且，该微型生物反应器可并行处理多达48个样品的高通量筛选。在微藻培养过程中，BioLector XT可精准调控重要培养参数，如光照、气体流量、气体组分、温度、pH和碳源补给等。

细胞生长监测

细胞大小是了解细胞周期、渗透应激补偿、细胞凋亡、发病机理、吞噬作用、物种多样性等各种细胞机制的关键参数。

Multisizer 4e库尔特计数器是一款可检测粒径为200nm至1,600μm的多功能颗粒计数和表征系统。

该系统基于库尔特原理，通过电感应区检测待测颗粒，无论该颗粒的性质或光学特性如何。悬浮在0.9%电解质溶液中的颗粒可通过小圆孔。小孔两侧溶液中的两根电极产生电流。每个颗粒通过小孔时，均取代相同体积的导电溶液，使小孔电阻瞬时增大，从而产生与颗粒体积成比例的电压脉冲。脉冲数量即表示颗粒数量，而产生的脉冲的高度取决于颗粒体积。⁴这使得研究人员可准确测定样品的体积、数量和细胞浓度，并实时检测大小变化。在下面的例子中， Multisizer 4e被用来评估微藻细胞培养中细胞大小的范围。

将藻类细胞培养样品置入10mL Accuvette ST样品杯中，并使用Isoton 2电解液按1∶200进行稀释。每次测量取500μL稀释液。所用小孔管为100μm，每次测量持续13秒。利用数字脉冲处理（DPP）技术对生成的数据进行处理。DPP能够采集、存储和显示每个脉冲信号。这意味着后续可以单独评估脉冲频谱的各个区域。

图3所示的实验DPP数据表明，此次培养的微藻大小在2~11.5μm之间。

图3.数字脉冲数据图。横纵坐标分别表示脉冲宽度与脉冲高度,虚线表示选择用于进一步分析的数据点。

可从这些原始数据中选择感兴趣的范围（图3中的虚线所示范围）创建不同的频率直方图（显示每个体积的细胞数量）。比如，图4显示选择5.5~9.5μm范围所产生的直方图。

图4. 样品细胞大小分布图（直径，μm）。

DPP技术可提供超高分辨率和准确度，如能检测1mL样品中的1个颗粒。这是目前其他技术无法企及的检测水平。因此，该技术的应用范围非常广泛。例如，Multisizer 仪器已被用于评估微藻小球藻 (Chlorella vulgaris) 在培养pH值变化后的生长性能。⁵此外，Multisizer还被用来评估用于研究甾醇生物合成的四种淡水绿藻（Chlorella variabilis、Chlorella sorokiniana、Chlamydomonas reinhardtii和Coccomyxa subellipsoide）的培养细胞丰度。⁶在另一项研究中，研究人员使用Multisizer建立了一个模型，用以预测微藻在珠磨机中的细胞破碎率。⁷破碎是藻类生物炼制的第一步，因为破碎后生物分子才释放到介质中，因此该模型对珠磨机优化和放大研究很有意义。

结论

BioLector XT高通量微型生物反应器和Multisizer 4e库尔特颗粒计数器均为具有直观用户界面的台式设备，可在实验室中用于优化和监测藻类细胞培养。

● 参考文献：

1. Thompson PA. Algal cell culture. Biotechnology, Enc. Life Supp. Syst. (EOLSS), 2002;Vol I:67-110.

2. Pulz O, Gross W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004;65(6):635-48. doi: 10.1007/s00253-004-1647-x.

3. Raja R, Hemaiswarya S, Kumar NA, Sridhar S, Rengasamy R. A perspective on the biotechnological potential of microalgae. Crit. Rev. Microbiol. 2008;34(2):77-88. doi: 10.1080/10408410802086783.

4. Rhyner M, Prestigiacomo G, Kumar K, Lee L. Cellular analysis using the Coulter principle. measurement with great accuracy and speed. Available from: https://www.mybeckman.uk/resources/reading-material/application-notes/cellular-analysis-using-the-coulter-principle.

5. Filali R, Tian H, Micheils E, Taidi B. Evaluation of the growth performance of microalgae based on fine pH changes. Austin J. Biotechnol. Bioeng. 2021;8. doi: 10.26420/austinjbiotechnolbioeng.2021.1109 .

6. Voshall A, Christie NTM, Rose SL, et al. Sterol biosynthesis in four green algae: a bioinformatic analysis of the ergosterol versus phytosterol decision point. J. Phycol. 2021,57:1199–1211. doi: 10.1111/jpy.13164-20-064.

7. Suarez Garcia E, Lo C, Eppink MHM, Wijffels RH, van den Berg C. Understanding mild cell disintegration of microalgae in bead mills for the release of biomolecules. Chem. Eng. Sci. 2019;203:380-390. doi: 10.1016/j.ces.2019.04.008.