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Cell文章优选芯片：特异性捕获&牢固偶联兼得，且看Biacore NTA

来源：Cytiva（思拓凡）分类：新品 2023-12-18 09:45:52 0阅读次数

芯片是什么？

是提供金膜形成SPR（表面等离子共振）现象的关键角色，也是给配体分子栖身之所的大本营。

Biacore芯片如何抓住配体分子？

CM系列芯片可依靠羧基与伯氨等基团的共价结合，而捕获类芯片则借助捕获分子与配体分子的特异性结合。

特异性捕获&共价偶联兼得

有这样一种芯片，既可以共价结合又可以特异性捕获，它是谁呢？本期就带您认识具有双重身份的Biacore NTA芯片。

在金膜之上，NTA芯片的羧基化葡聚糖表面上修饰了NTA（次氮基三乙酸），NTA加Ni²⁺赋予其“捕获”功能，而未完全修饰的羧基基团则赋予其“偶联”的功能。使用“捕获”功能，可以得到特异性、可逆的捕获芯片，而同时使用“捕获”+“偶联”，就可以牢固地偶联His标签配体蛋白，且不需低pH缓冲液稀释。一张芯片，“双重”身份。

捕获：

NTA可通过螯合Ni²⁺，特异性捕获His标签蛋白，进一步检测此His标签蛋白与其他分子（无His标签）的动力学/亲和力检测等实验，实现可逆捕获检测实验。

图1：使用NTA芯片捕获法检测His标签配体-分析物

Biacore提供成熟的NTA芯片及配套试剂盒，包含了实验中会用到的螯合及再生试剂。控制软件中选择Kinetics/affinity using Sensor Chip NTA（Insight software of 1 series and 8 series & Control software of S200，X100及T200在Kinetics/affinity-芯片类型选择NTA即可）即可开展实验。具体实验流程包括：

General：芯片表面螯合Ni²⁺；

Capture：捕获His标签配体 (Ligand in running buffer) ；

Analyte：进样分析物，检测与配体的结合和解离过程。单循环实验中，可以在此步设置中一个循环设置多个浓度，直接得到浓度梯度的结果；

Regeneration：用EDTA洗去Ni²⁺及配体。

整个循环结束后，芯片回归到初始状态，可以用于其他His标签配体的检测。需要注意的是，分析物不可以有His标签，否则会直接结合在Ni²⁺上，影响检测结果。

熟悉His标签的老师可能会问：必须用EDTA再生么？当然不是。Kong et al. 使用NTA捕获法检测14–3-3ζ蛋白与化合物的结合时，化合物与靶点蛋白可以完全自发解离（快解离），因此不设置再生^[1]；Lu et al. 使用NTA捕获法检测膜蛋白A₂AR与化合物的结合，使用5 mM theophylline再生洗掉分析物而保留配体^[2]。

捕获+偶联：

今年Cell杂志上发表的以Clp蛋白酶为靶点的新型抗结核病BacPROTACs研究成果，就是使用NTA芯片说明书中的Capture & Coupling的方法，检测ClpC3与天然抗生素或HBPs (Homo BacPROTACs) 的结合^[3]。

图2：NTA芯片Capture & Coupling后，单循环检测ClpC3与药物的亲和力

“捕获”+“偶联”可使His标签配体蛋白稳定地共价结合在芯片。区别于CM系列芯片，NTA芯片并不通过静电吸附达到富集的目的，而是利用Ni²⁺与His标签的特异性结合，所以配体分子不需要使用低pH的醋酸钠缓冲液，用运行缓冲液稀释即可。

在Biacore控制软件中选择Immobilization-芯片类型选择NTA-add step-NTA Amine（Insight software of 1 series and 8 series， X100、T200及S200可在偶联方法中自定义偶联方法）即可开展实验。具体实验流程包括：

General：芯片表面螯合Ni²⁺；

Activation：EDC/NHS活化；

Capture：捕获His标签配体 (Ligand in running buffer) ，同时发生捕获和偶联。除了设置配体进样时间外，Biacore特有的Aim for target level模式，无需紧盯偶联信号，不用担心偶联多了、少了，只需要输入想要的偶联量，仪器自动调整进样时间，准确达到目标偶联量。精准偶联So Easy；

Deactivation 1：乙醇胺封闭；

Deactivation 2：用EDTA洗去Ni²⁺。

图3：NTA芯片捕获+直接偶联，target模式下自动完成目标偶联量

NTA-Amine实验结束后，His标签配体分子被牢牢地偶联在芯片上，等同于CM系列芯片的氨基偶联。后续的动力学/亲和力检测可按照实验需求，设置结合解离及再生步骤，再生并不会洗掉配体。值得注意的是，偶联完成后芯片上没有了Ni²⁺，所以分析物有无His标签都可检测。

十八般芯片，给Biacore带来了十八般武艺，满足分子互作的各种应用需求。更多芯片的花式玩法等你发现！

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参考文献

[1] Kong D, Ye C, Zhang C, et al. Procoxacin bidirectionally inhibits osteoblastic and osteoclastic activity in bone and suppresses bone metastasis of prostate cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Feb 9;42(1):45, https://doi: 10.1186/s13046-023-02610-7.

[2] Lu Y , Qin S , Zhang B , et al. Accelerating the Throughput of Affinity Mass Spectrometry-Based Ligand Screening toward a G Protein-Coupled Receptor[J]. Analytical Chemistry, 2019, 91(13).

[3] Hoi, David M et al. Clp-targeting BacPROTACs impair mycobacterial proteostasis and survival. Cell, S0092-8674(23)00404-X. 27 Apr. 2023, doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.009.

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