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技术分享 | 流感不惧，准确的“高效”利器-Roche Digital LightCycler在人畜共患病公卫领域的案例分享

来源：广州云星科学仪器有限公司分类：动态 2023-11-09 13:52:50 58阅读次数

数字PCR技术简述

基于数字芯片纳米孔或微流控液滴原理开发的数字PCR(Digital PCR，dPCR)是继实时荧光定量 PCR( Real-Time quantitative PCR，qPCR) 之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行 PCR 扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统 PCR 技术相比，数字 PCR 技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。

纳米微孔板 dPCR 工作流程涉及四个基本步骤：移液及加载分区、运行实验和检测分析结果。原则上，其理念与 qPCR 相似。关键的差异在于，dPCR 可在维持定量成本的情况下具有精确性和灵敏度增益。目前纳米微孔芯片式dRCR workflow模式如下：

图1 dRCR的实验流程

图2 数字PCR的数据分析操作流程（图片引自Roche Diagnostic）

图3 对于具有28,000个分区的孔芯片，总泊松、取样和分区误差，表示为%CV。分区误差为总泊松误差减去取样误差。当每个分区的平均拷贝数约为1.6时，总泊松误差达到其最小值。

图4 dPCR引入泊松分布的概览图

dRCR在人畜共患病早筛领域的应用

病毒感染相关的早筛分析核

dPCR可以检测各种人和动物疫病的病原体，例如甲型乙型流感（A.flu）、轮状病毒（Rotavirus）、非洲猪瘟(Swine fever)等等，其优势在于其高灵敏度和可重复性。dPCR技术可以检测样品中非常低浓度的病原核酸，灵敏度相对于qPCR通常高5-100倍，因此可以在早期发现阳性病例，从而避免疾病的扩散传播。

图5 qPCR线性梯度分辨：以10 copy/ml猪原PoRV感染的GAPDH检测为例

图6 dPCR线性梯度分辨：

可重复高度均一检测出1/100K稀释的样本

畜牧家畜防疫方向的基因亚型检测

多色荧光探针qPCR实验是指一次PCR扩增反应即可实现对多种SNP或小范围indels检出的能力，相较单个靶标的qPCR 实验。但是仍然存在许多影响多重PCR扩增与检测效果的因素，其中多个靶标扩增效率的一致性是最大的难题，检测探针越多，不同差异的扩增效率会带来结果影响。dRCR采用终点法判断荧光信号和纳米微孔分区技术，检测结果不受扩增效率和标准曲线效应，能准确定量和避免漏检。

目前主流品牌的dRCR仪均有多个检测通道，比如罗氏诊断的Digital LightCycler dPCR仪拥有6个检测通道+质控通道，可实现6色水解探针标记的病原检测。下图应用Roche dRCR仪同时检测H5N1、H7、H9禽流感亚型和鸡瘟新城疫病毒4个亚型，各检测通道间无干扰，定量结果准确性高。

图7 罗氏Digital LightCycler数字PCR仪的多色探针实验（数据来源：Roche Diagnostic）

重组活病毒疫苗效价鉴定

dPCR可对AAV病毒疫苗等活载体疫苗的载体基因表达进行滴度拷贝数（Copy Number）和空壳率(Empty Full Capsid Ratio)鉴定，作为生产过程中亦可以为活性滴定、质量体系建立的高效工具。同时，dPCR可定量动物血清中微量的病毒或微生物污染，可作为生物制剂、疫苗生产纯度效果做评估指标。

绝对定量分析

常规组织和血液等样品中，由于单个突变的体细胞含量低，使得检出其存在变得困难。而 dPCR 可对复杂的大背景进行有限的稀释或分区，通过有限稀释，降低野生基因型的背景信号，使得低表达的目的序列能够被灵敏的检出，特别适用于稀有突变的检测应用。研究表明，低至 1/100000 的变异频率能被检测出来。并且随着反应室数量的增加，对稀有变异的分析更灵敏。

转基因食品和成分检测

欧盟国家对转基因食品有着严格的限定，而目前，一般采用实时qPCR 用于商品中转基因的分子定量分析。但是在一些复杂的食物原料和饲料原材料中，目标DNA非常少，使得对其的检测和定量受到限制。dPCR 为国内外研究人员提供了新的方法。Morisset等用ddPCR对MON810 转基因和Hrg标记的玉米参考基因进行绝对定量鉴定。研究表明，dPCR 对低浓度的检测具有更高的重复性，并且对抑制剂具有更高耐受性。Dobnik 等用多重 ddPCR 检测定量 12 个欧盟授权转基因玉米，对于含转基因组织样品中，该方法比实时定量 PCR 更高通量、更高效。

对接NGS测序平台方面的应用

dPCR 对 NGS 的测序结果进行验证，对诸如单核苷酸多态性，突变及拷贝数变异在内的基因组变异进行验证，确保测序结果的可信度；另一方面，所得到的结果还包含反映测序文库质量的信息，如接头与接头二聚体、错误连接片段、过长连接片段等，这是当前其他方法所不具备的优势。Alikian 等研究表明，在慢性粒细胞白血病患者的检测中，dPCR 比 qPCR 更准确，定量分析结果可靠性高、重复性好。

纳米微孔芯片数字PCR仪新势力

Digital LightCycler数字PCR仪是罗氏最新推出的高性能产品，充分拓展数字PCR的应用领域，其具备高度自动化的硬件设计的特点（如下图6-7），此外该系统可通过实验室信息系统（LIS）对样本进行信息自动化溯源，具有操作简便、通量高、速度快、通道全等性能和优势。

3种独特的纳米芯片板，满足不同应用实验场景

6通道多重检测+参比通道

5倍浓缩的试剂预混液（含质控试剂）

单次可检测三种芯片板组合(8个样/芯片)，最高通量96个样本

可检出等位基因低于0.1%的稀有突变

最快1.5小时出报告

图8 罗氏Digital LightCycler 数字PCR仪上样步骤

图9 罗氏Digital LightCycler 数字PCR仪主机界面

结语

dPCR以明显的技术优势，已经广泛应用于新冠病毒、流感病毒监测方向等公卫领域；目前，市场上已有多款商业化的数字PCR 仪器出现，对进一步拓展和深化数字PCR 技术的应用具有积极的促进作用。Roche Diagnosis推出的Digital Lightcycler可有效解决 dPCR实验通量少、样品浪费、假阳性无法检出等环节问题，并实现操作上面的智能化分析方案，凭借其推出的高精度和灵敏度、高弹性的芯片场景方案，预计dPCR 将在临床研究、基因治疗、肿瘤预后、微生物检测和食品安全检测等方面拥有更广阔的应用前景。

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