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杨艳 冉良骥

据市场分析^[1]：mRNA药物的市场规模短期取决于COVID-19疫苗的销售，但是随着其他预防性疫苗和治疗性疫苗产品的推出，mRNA药物市场预计从2028年开始增长，2035年将达到230亿美元。其中预防性疫苗市场份额超50%，治疗性疫苗约占30%，治疗性药物占比不到20%。2023年至2024年5月，NMPA共受理了5款mRNA的预防性疫苗，其中4款是2024年获批临床试验。

mRNA的纯度检测非常重要，某些杂质可能引起免疫原性、减少mRNA翻译为蛋白。通过液相色谱仪结合不同分离机理的色谱柱进行mRNA纯度检测是常用、稳定且快速的手段，但不同模式下，流动相和色谱柱差别较大，如何快速开发最适合的色谱条件是分析人员面临的一大挑战。

实验测试不同pH的25 mM己胺（HAA）、100 mM 三乙胺（TEAA）、25 mM二异丙基乙胺（DIPEA）体系流动相对2500 nt的mRNA纯度分离的影响，反相色谱柱DNAPac RP（4 μm 2.1*100 mm），发现pH8.5的25 mM HAA对该mRNA样品分离效果最好，见图3。

图3. 2500 nt的mRNA在pH8.5的25 mM HAA体系下的色谱图（点击查看大图）

实验测试不同pH的25 mM HAA、100 mM TEAA、25 mM DIPEA体系流动相对12000 nt的mRNA纯度分离的影响，反相色谱柱DNAPac RP（4 μm 2.1*100 mm），在pH8.5的100 mM TEAA体系下，该mRNA样品分离效果最好，见图4。

图4. 12000 nt的自复制mRNA在pH8.5的25 mM HAA体系下的色谱图（点击查看大图）

采用Tris和氯化钠、tris和高氯酸钠、氢氧化钠和氯化钠、氢氧化钠和高氯酸钠体系及上述体系分别加10%乙腈，按照正交实验设计，测试不同盐体系和柱温对2500 nt的mRNA样品的分离情况，离子交换色谱DNAPac PA200 RS （4 μm 4.6*150 mm），最佳分离该样品的流动相组合：流动相A为40 mM Tris pH9、流动相B为40 mM Tris，0.8 M 高氯酸钠，20%乙腈， pH9，柱温80℃，样品谱图见图5。

图5. 2500 nt的mRNA在tris、高氯酸钠体系下的色谱图

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对12000 nt的自复制mRNA进行SEC液相色谱开发，使用孔径2000?的SEC色谱柱（5 μm 7.8*300 mm），在pH7的100 mM磷酸盐条件下等度分析，该样品的聚体、主峰和片段具有较好的分离，见图6。

图6. 12000 nt的自复制mRNA的SEC色谱图

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[1]Wen Xie,Baiping Chen,John Wong.Evolution of the market for mRNA technology.Nature,2021.

[2]Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality,Draft guidelines:2nd Edition.USP,2023.

[3]AN000471-HPLC-Simultaneous reversed-phase and anion-exchange method scouting with a dual system for mRNA impurity determination.

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